Requisiti per la raccolta e la preparazione di materiale biologico per studi ematologici.

Requisiti per il trasporto e lo stoccaggio di materiale biologico per studi ematologici.

Corretto riempimento della direzione per lo studio del sistema emostatico:

Nome completo, età, sesso del paziente

Tempo di prelievo di sangue per la ricerca

Diagnosi clinica (brevemente)

Ematocrito

Sindrome emorragica (sanguinamento nasale, uterino, ecc.), trombosi (indicare la localizzazione), shock, insufficienza multiorgano, trauma, sindrome da compressione prolungata, ustioni, ecc.)

Indicare i farmaci assunti che influiscono sui parametri dell'emostasi, indicando dosaggio, modalità e data dell'ultima somministrazione

Vengono osservati l'intervallo di tempo per il campionamento (sangue), le restrizioni dietetiche e di esercizio:

Il prelievo programmato del sangue viene effettuato dalle 7 alle 9 del mattino, con il paziente sdraiato o seduto. Quando si studia l'emostasi in dinamica, è desiderabile prelevare il sangue nella stessa posizione del corpo del precedente.

Il sangue viene prelevato a stomaco vuoto, 12-14 ore dopo l'ultimo pasto.

Prima di prelevare il sangue, è auspicabile che il paziente riposi per 15 minuti.

Eccezioni: studi di emostasi da cito, valutazione di APTT.

Alla vigilia di uno studio programmato (entro 24 ore), il paziente si astiene da uno sforzo fisico significativo, dall'assunzione di alcol. È auspicabile che il paziente non mangi cibi grassi alla vigilia del prelievo di sangue.

L'intervento chirurgico porta a un cambiamento dell'emostasi per un periodo da diversi giorni a diverse settimane.

I fattori che influenzano l'emostasi comprendono iniezioni, infusioni, trasfusioni, punture, biopsie, massaggi, dialisi, introduzione di agenti radiopachi, immunoscintiografia, radiazioni ionizzanti, esame endoscopico, diete speciali.

REGOLE PER IL PRELIEVO DEL SANGUE

Il sangue viene prelevato da una vena periferica (di solito la cubitale).

Il prelievo di sangue viene effettuato solo utilizzando un sistema di campionamento sottovuoto in provette con una speciale marcatura a colori a seconda dell'anticoagulante utilizzato ( citrato di sodio 3,2%) nel rapporto: 1 volume di citrato di sodio a 9 volumi di sangue.

Per la ricerca livelli piastrinici prendere il sangue in una provetta con EDTA(codifica colore lilla). Lo studio del livello delle piastrine è prescritto in assenza di un esame del sangue clinico o quando si ottengono valori patologici del livello delle piastrine in un esame del sangue clinico

È consentito un breve laccio emostatico, non più di 60 secondi. Rimuovere il laccio emostatico immediatamente dopo che l'ago è entrato nella vena. Per il prelievo di sangue per lo studio del sistema di coagulazione, è importante non poter massaggiare le vene, bussare su di esse.

Utilizzare un ago per la raccolta del sangue con un diametro interno di 0,7-1 mm (misura 19-22).

L'uso di una siringa è inaccettabile a causa dell'attivazione delle piastrine e dei fattori di coagulazione del sangue da parte del movimento turbolento del sangue e della sua miscelazione con l'aria (schiuma). È escluso quando si utilizzano contenitori sottovuoto.

Dopo aver inserito l'ago nella vena, collegare il contenitore sottovuoto, il sangue inizierà a fluire nel contenitore per gravità.

Prelevare il sangue per l'esame coagulologico secondo provetta, primo utilizzo per altri studi, ad esempio biochimici. Se si desidera prelevare prima la provetta di coagulazione, aspirare i primi 5 ml di sangue in una provetta vuota e gettarli impedire alla tromboplastina tissutale di entrare nel campione.

Mescolare delicatamente il sangue subito dopo la raccolta senza formare schiuma con l'anticoagulante (capovolgere la provetta 3-4 volte).

Dopo il prelievo di materiale biologico, controllare il campione di sangue. Il controllo accurato dei campioni di sangue evita i seguenti errori: rapporto errato dei volumi di sangue/citrato; sangue parzialmente coagulato.

Il sangue viene consegnato al laboratorio entro 45 minuti dal prelievo. Durante il trasporto, il sangue non deve essere agitato. I campioni di sangue non devono essere trasportati a temperature inferiori a 4°C e superiori a 30°C.

Assistente paramedico-laboratorio (tecnologo medico) svolge:

controllo di input del sangue erogato, tra cui: 1) verifica della correttezza della compilazione del form di segnalazione. 2) verifica dell'adeguatezza del volume di sangue erogato secondo l'etichetta sulla provetta, 3) verifica dell'assenza di coaguli nel campione quando la provetta viene inclinata lentamente.

centrifugazione del sangue erogato al fine di ottenere:

plasma ricco di piastrine ( parametri di centrifugazione: rpm = 1000 rpm (circa 150-200 g), tempo di centrifugazione 5-7 minuti.

Per selezionare le condizioni di centrifugazione ottimali, sono guidati dalla forza centrifuga (g). Puoi usare la formula:

g = 1,118 x 0,00001r x n2,

dove r è il raggio della centrifuga - la distanza in centimetri tra l'asse del rotore e il centro della provetta nella sede della centrifuga; n è il numero di giri al minuto.

plasma povero di piastrine parametri di centrifugazione: rpm = ~2500-3000 rpm (circa 1500-2000 g), tempo di centrifugazione 10-20 minuti. Per la rimozione completa delle piastrine, viene eseguita una centrifugazione ripetuta, i parametri di centrifugazione rimangono gli stessi.

3. Dopo la centrifugazione, controllare il colore e la trasparenza del plasma: un campione emolizzato, plasma itterico o lipemico (chiloso) non sono soggetti a esame.

Dopo la centrifugazione, il supernatante viene rimosso.

Auspicabile studiare i parametri dell'emostasi durante 2 ore dopo il prelievo di sangue, ma permesso studio dei parametri coagulologici in entro 4 ore se il plasma è stato separato dal sedimento di eritrociti e leucociti.

Se necessario conservazione a lungo termine campioni "freschi" (non oltre 2 ore dopo il prelievo di sangue) plasma privo di piastrine può essere una volta congelare e conservare fino a 2 settimane a -20°C o fino a 6 mesi a -70°C. Il plasma deve essere scongelato rapidamente in acqua tiepida (+36°C), miscelato accuratamente ed esaminato immediatamente. Dopo il congelamento, è possibile modificare l'APTT.

Metodo di preparazione di micropreparati per studi ematologici, metodi di fissazione e colorazione.

Metodo di preparazione degli strisci di sangue per studi ematologici.

Preparazione e lavorazione dei bicchieri. I nuovi bicchieri puliti possono essere utilizzati dopo lo sgrassaggio in una miscela di Nikiforov (parti uguali di alcol etilico al 96% ed etere). I bicchieri usati vengono immersi per un giorno in una soluzione saponosa calda o in una soluzione di detersivo (1 cucchiaio di polvere per 5 litri di acqua). Il giorno dopo, la soluzione viene drenata, il vetro viene lavato con acqua corrente. Quindi vengono nuovamente versati con una soluzione saponosa calda o una soluzione di detersivo e portati a ebollizione, fatti bollire nella stessa soluzione per 5-10 minuti (non di più, per evitare di appannare i bicchieri). Dopo aver raffreddato la soluzione, viene nuovamente drenata, i vetrini vengono risciacquati con acqua corrente e ogni vetrino viene lavato con una spazzola sotto l'acqua corrente. I bicchieri così trattati vengono adagiati su un telo pulito ad asciugare. I bicchieri puliti per lo sgrassaggio vengono posti in una miscela di Nikiforov o alcol etilico al 96% per 60 minuti, quindi asciugati e conservati in un contenitore pulito con un collo largo. Si consiglia di prendere gli occhiali puliti con una pinzetta o con le mani lungo i bordi laterali.

Preparazione degli strisci. Una piccola goccia di sangue viene applicata su un vetrino preparato a secco più vicino al lato corto con un'asta di vetro (o direttamente dal sito della puntura del dito). Lasciare il bicchiere in posizione orizzontale e spalmare il sangue sul bicchiere con un bicchiere asciutto, pulito e smerigliato, tenendolo ad un angolo di 45°. Con un bordo corto, dopo aver atteso che tutto il sangue si sia sparso su di esso, vengono rapidamente aspirati su un vetrino. Non dovrebbe esserci una forte pressione sul vetrino, in quanto ciò può danneggiare i globuli. Le macchie vengono asciugate all'aria e contrassegnate (preferibilmente con una matita semplice). La macchia essiccata dovrebbe essere uniformemente sottile, di colore giallastro, di dimensioni sufficienti, situata a una distanza di 1,0-1,5 cm dai bordi del bicchiere, occupare quasi l'intera lunghezza del bicchiere e terminare con una "pannocchia". Non devono essere utilizzati strisci spessi (rosa intenso), poiché la morfologia cellulare è difficile da discernere in essi.

Gli strisci di qualità standard si ottengono utilizzando dispositivi automatici progettati per la preparazione di strisci e prodotti da diverse aziende.

Fissazione e colorazione di strisci di sangue. Prima della colorazione, gli strisci di sangue vengono solitamente fissati per 5-10 minuti in alcol metilico per prevenire l'emolisi, che può verificarsi a contatto con l'acqua durante il processo di colorazione con un colorante idrosolubile o al successivo contatto con l'acqua. Le tecniche di fissazione sono descritte di seguito insieme alle tecniche di colorazione. La fissazione non è richiesta per i coloranti Wright e Leishman, poiché questi coloranti contengono alcol metilico.

I tamponi asciutti possono essere conservati per 2 giorni in un luogo asciutto e caldo; in un'atmosfera calda e umida senza fissazione, vengono conservati molto meno.

I globuli contengono strutture basofile e acidofile che differiscono per reazione (pH). I nuclei sono basofili e si colorano di blu. Anche i granuli basofili altamente basofili (acidi) sono blu. L'emoglobina (essendo basica) si colora in modo acidofilo, cioè rosso. La colorazione con una combinazione di coloranti acidi e basici è chiamata colorazione Romanovsky e presenta varie modifiche (Pappenheim, Wright, Noht, Leishman, Giemsa, Jayner, ecc.). Il blu di metilene viene solitamente utilizzato come colorante principale, ma viene utilizzato anche il blu di toluidina. Come colorante acido vengono utilizzati eosina, azzurro I e azzurro II.

Criteri per una buona colorazione: colore rosa degli eritrociti, colorazione viola della granularità dei neutrofili su sfondo rosa, delicata granularità azzurofila dei monociti.

Per diluire la vernice, è meglio usare acqua distillata fresca neutra. L'acqua distillata stantia diventa acida a causa della cattura di anidride carbonica dall'atmosfera. Se l'acqua distillata è alcalina, i globuli rossi assumono un colore verde-bluastro sporco; quella parte dei leucociti che dovrebbe essere colorata di blu diventa viola, i granuli eosinofili diventano bluastri e verdastri invece che rosa e i granuli neutrofili vengono ricolorati. Nell'acqua acida, gli eritrociti diventano di un arancione brillante e i nuclei dei leucociti sono molto pallidi. L'ideale è l'acqua distillata con un pH di 7,0, che viene tamponata per preservarla. È possibile utilizzare pastiglie tampone pronte all'uso che vengono sciolte in acqua distillata.

Per la colorazione di strisci di midollo osseo, è ideale una colorazione con pH 7,4-7,5.

I metodi di colorazione secondo Noht e Pappenheim sono accettati come unificati.

Reagenti per la fissazione: 1) alcool metilico o 2) soluzione May-Grunwald eosina-blu di metilene.

Reagenti per macchiare le macchie secondo Nokht: 1) soluzione basica di azzurro I: 1 g di vernice viene sciolto in 1 litro di acqua distillata, lasciato in un piatto di vetro scuro per 12-14 giorni a temperatura ambiente, dopodiché viene utilizzato; 2) soluzione basica di eosina di potassio: 1 g di vernice viene sciolto in 1 litro di acqua distillata, lasciata in un contenitore di vetro scuro per 12-14 giorni a temperatura ambiente, dopodiché viene utilizzata; 3) tampone fosfato (miscela Weise), pH 7,4-7,5: mescolare 0,49 g di potassio diidrogeno fosfato (KH2PO4) e 0,909 g di sodio idrogeno fosfato (Na2HPO4) e sciogliere in 1 litro di acqua distillata; 4) soluzione di lavoro di azzurro-eosina: prima dell'uso, mescolare 25 ml della soluzione madre di azzurro II, 20 ml della soluzione madre di eosina di potassio e 55 ml della soluzione tampone (le proporzioni dei coloranti possono variare, sono stabilite empiricamente quando si preparano lotti freschi di soluzioni madre).

Reagenti per la colorazione degli strisci secondo Pappenheim: 1) una soluzione di eosina-blu di metilene secondo May-Grunwald. In assenza di una soluzione colorante pronta, si prepara sciogliendo 1 g di vernice secca in 1 litro di alcol metilico; 2) soluzione funzionante di azzurro-eosina secondo Nokht.

Fissazione di sbavature. La soluzione di fissaggio viene versata in una cuvetta o in un piatto a bocca larga con un tappo macinato. Le macchie vengono poste in un contenitore, che viene immerso in una cuvetta o posto uno per uno in un piatto per 5-10 minuti. Il contenitore con i bicchieri viene rimosso dalla soluzione di fissaggio (oppure i bicchieri vengono estratti con una pinzetta e posti su un supporto) e lasciati all'aria fino a completa asciugatura.

La colorazione secondo Nocht. Gli strisci fissi essiccati, senza rimuoverli dal contenitore, vengono posti in una cuvetta con una soluzione di vernice funzionante per un tempo rigorosamente definito (20-45 minuti), che viene selezionato empiricamente per ogni lotto di vernice. In assenza di una cuvetta con un contenitore, il bicchiere viene posizionato orizzontalmente su due bacchette di vetro ("guide") poste parallelamente alla corsa verso l'alto e su di esse vengono versati 3-4 ml della soluzione di lavoro della vernice. Il contenitore con i bicchieri viene estratto dalla cuvetta con il colorante e posto in una cuvetta con acqua di rubinetto (in assenza di contenitori, la vernice viene lavata via dai bicchieri con acqua senza rimuoverli dalle bacchette di vetro). Le macchie vengono asciugate all'aria.

Colorazione Pappenheim. Strisci di sangue asciutti non fissi vengono posti in un contenitore e abbassati in una cuvetta con la soluzione May-Grunwald per 3-5 minuti (o 3-4 ml di colorante vengono versati su uno striscio non fisso con una pipetta). Il contenitore con le macchie viene risciacquato in una cuvetta con acqua distillata, quindi collocato in una cuvetta con vernice azzurra-eosina secondo Nokht per 8-15 minuti. L'acqua distillata viene aggiunta ai vetrini posti sui "binari", senza drenare il colorante, per 1 minuto, quindi la vernice viene versata sullo striscio per 8-15 minuti, quindi la vernice viene lavata via con acqua. Le macchie vengono asciugate all'aria.

Colorazione secondo Romanovsky-Giemsa. Prodotto allo stesso modo di Nokht. Come colorante viene utilizzata una soluzione Romanovsky-Giemsa già pronta, che viene diluita prima dell'uso alla velocità di 1 goccia di colorante per 1 ml di acqua distillata. Il tempo di colorazione è impostato empiricamente per ogni lotto di colorante (25–40 min).

Colorazione Wright. Reagenti. 0,2 g di colorante di Wright (polvere secca, BDH/E. Merck) vengono sciolti in 100 ml di metanolo e lasciati riposare per diversi giorni. Se gli eritrociti non sono colorati in modo sufficientemente chiaro, preparare una soluzione allo 0,25% o allo 0,3%.

Progresso nella colorazione. Alcune (circa 8) gocce di vernice vengono applicate sullo striscio, lasciate riposare per 2-3 minuti (assicurarsi che la vernice non si asciughi), quindi una uguale quantità di acqua tamponata viene versata sullo striscio. Se la vernice è maturata, sulla superficie della vernice diluita apparirà una schiuma o una pellicola con una lucentezza metallica. La vernice diluita viene lasciata sullo striscio per 2-3 minuti, quindi lavata via con una soluzione tampone o acqua. La vernice non deve depositarsi sulla superficie dello striscio. Se ciò accade, lo striscio viene riempito con vernice non diluita per 15-20 secondi e poi di nuovo con una soluzione tampone o acqua.

Preparazione del tampone fosfato.

Soluzione A (0,2 M KH2PO4): sciogliere 27,2 g di sale in 1 litro di acqua distillata.

Soluzione B (0,2 M Na2HPO4): sciogliere 35,6 g di Na2HPO4 × 2H20 in 1 litro di acqua distillata.

Per ottenere 100 ml di una soluzione tampone con il pH desiderato, le soluzioni A e B devono essere drenate nelle quantità indicate in tabella. Il valore del pH viene controllato con un pHmetro.

Preparazione della soluzione tampone fosfato

Soluzione, ml	valore del ph

Colorazione Leishman. Reagenti. 0,15 g di vernice secca di Leishman vengono sciolti in 133 ml di alcol metilico assoluto. La vernice dovrebbe dissolversi completamente, si consiglia di macinare preventivamente i cristalli di vernice in un mortaio. Conservare la vernice in una bottiglia con tappo di vetro, non filtrare.

Progresso nella colorazione. Eseguito in modo simile alla colorazione di Wright, ma con una doppia diluizione della soluzione tampone. Alcune gocce di vernice (circa 8) vengono versate su una macchia, conservata per 2 minuti. Aggiungere una doppia quantità di soluzione tampone (16 gocce), mescolare facendo oscillare e lasciare agire per 7-10 minuti. La vernice viene lavata via con acqua distillata in 2-3 secondi. Con lavaggi più lunghi, il colore si deteriora. Le macchie vengono asciugate in una griglia all'aria.

Preparare una densa goccia di sangue. Tre gocce di sangue applicate su un vetrino a una certa distanza l'una dall'altra vengono espanse con l'angolo di un vetrino pulito fino a una dimensione di circa 1 cm di diametro, contrassegnate con una matita, quindi asciugate all'aria per 1-2 ore.

Colorare una densa goccia di sangue. Gocce spesse di sangue non sono riparate. I vetrini con gocce spesse ben essiccate vengono posti sui "binari" a una certa distanza l'uno dall'altro e la soluzione di lavoro di eosina azzurra secondo Nokht viene versata su di essi per 8-10 minuti. C'è una "lisciviazione" di eritrociti. Quindi la vernice viene drenata e una nuova porzione della soluzione di lavoro di eosina azzurra secondo Nokht viene versata sui preparati per 30-35 minuti. I vetrini vengono quindi accuratamente risciacquati con acqua distillata e asciugati.

Colorazione automatica delle macchie

Poiché una delle funzioni più richieste nel laboratorio di ematologia è la preparazione e la colorazione degli strisci di sangue, i tentativi di automatizzarli sono naturali.

Il primo sistema automatico di preparazione degli strisci è stato sviluppato da Sysmex (Giappone) nel 1990 e attualmente sono installati più di 1600 sistemi in tutto il mondo. La vasta esperienza accumulata durante questo periodo è stata utilizzata nello sviluppo di un sistema di nuova generazione: una stazione di colorazione e preparazione degli strisci SP-1000i completamente automatizzata con una capacità fino a 120 strisci all'ora. L'SP-1000i realizza un elevato grado di standardizzazione e qualità nella preparazione dello striscio utilizzando il metodo a cuneo intelligente, che consente all'utente di regolare la quantità di campione di sangue applicato, l'angolo della lama di striscio, la velocità di applicazione e il tempo di attesa, a seconda sull'ematocrito del campione in esame, utilizzando da 8 a 16 diversi livelli di regolazione. Il prelievo di sangue può essere eseguito manualmente o automaticamente da provette aperte o chiuse. Stazione automatizzata per la preparazione e la colorazione degli strisci Sysmex SP-1000i (Giappone)

Il sistema utilizza fino a sette protocolli di colorazione personalizzabili in modo flessibile che consentono di standardizzare la qualità della colorazione degli strisci e soddisfare i requisiti più elevati. È possibile utilizzare i seguenti protocolli per la colorazione doppia e singola: secondo May-Grunwald-Giemsa, secondo Romanovsky e secondo Romanovsky-Giemsa. Gli strisci di sangue vengono colorati in un sistema a cassetta dedicato che contiene un solo vetrino per cassetta. Con questo metodo è garantita una buona relazione tra lo striscio di sangue ei reagenti coloranti e non vi è evaporazione del metanolo dal reagente nell'aria. Per garantire una buona fissazione del sangue prima della colorazione, nel processo di colorazione è integrata una fase separata per il prefissaggio del metanolo.

Grazie alla flessibilità del protocollo di colorazione, è possibile utilizzare un protocollo specifico per la colorazione del midollo osseo.

Metodo per la preparazione di strisci di midollo osseo per studi ematologici.

Esame del midollo osseo - Mielogramma La prima domanda a cui un esame del midollo osseo deve rispondere è l'aspetto quantitativo delle cellule. È noto che in relazione al sangue periferico è possibile determinare una serie di valori numerici per il numero e la percentuale di diversi tipi di cellule, poiché sono allo stato libero e sono distribuiti in modo relativamente uniforme nella sospensione del sangue vascolare . Una cosa completamente diversa si può dire del midollo osseo: la composizione del tessuto ematopoietico è molto eterogenea e la distribuzione delle cellule del midollo osseo non è la stessa. Pertanto, il conteggio diretto dei mielocariociti nella camera oscilla in un intervallo molto ampio, sia nello stato normale che nell'ambito della stessa malattia. I valori da noi rivelati alle persone variavano normalmente da 27.000 a 112.000 elementi nucleari per mm3 (Ursya). I dati della letteratura fluttuano ancora più ampiamente, con limiti di 12.000 e 300.000 per mm3 (Cartwright, Page). Dopo la centrifugazione, nel tubo dell'ematocrito si trovano i seguenti 4 strati: 1) strato giallo grasso superiore; 2) plasma; 3) uno strato grigio-biancastro formato da cellule nucleari; 4) uno strato rosso composto da eritrociti. La misurazione dello strato grigio-biancastro delle cellule nucleate (mielocrito) è di valore limitato o addirittura fuorviante, poiché i valori riscontrati negli individui normali mostrano anche fluttuazioni significative. Inoltre, le cellule nucleari si trovano non solo in questo strato, ma anche negli strati di grasso ed eritrociti. Ma strisci di concentrato di midollo osseo possono essere preparati dallo strato grigio-biancastro dopo la rimozione del plasma surnatante. Si sono rivelati utili nel processo diagnostico nei casi in cui gli strisci diretti sono poveri nelle cellule. Dato che la conta delle camere dei mielocariociti e le determinazioni del mielocrito forniscono solo risultati approssimativi con riproducibilità limitata, questi metodi di quantificazione non sono soddisfacenti. Il materiale estratto durante la puntura di aspirazione è un campione di midollo osseo misto a sangue in varie proporzioni. Il grado di diluizione del midollo osseo con il sangue dipende da una serie di fattori. L'etichettatura 32P ha dimostrato che la diluizione del midollo osseo aspirato con il sangue varia dal 40% al 100%. Tuttavia, va notato che lo studio del midollo osseo per fare una diagnosi si basa principalmente su uno studio qualitativo del contenuto cellulare, e solo secondariamente sui valori quantitativi di tale contenuto. Ecco perché i metodi quantitativi per la determinazione delle cellule del midollo osseo consistono in una valutazione semiquantitativa della composizione cellulare del midollo osseo, rispetto ai campioni normali, su: a) strisci con grumi frantumati; b) sezioni istologiche. Lo studio dello striscio viene effettuato prevalentemente con lente asciutta, su più strisci, con i seguenti obiettivi: a) valutazione semiquantitativa della massa cellulare del midollo osseo; b) determinazione della presenza e della densità dei megacariociti; c) rilevamento di cellule giganti o nidi di cellule anormali; d) individuazione delle aree più idonee alla ricerca per immersione. Sugli strisci ottenuti per frantumazione di particelle di midollo osseo si distinguono le seguenti tre zone concentriche: a) centrale; b) esterno; c) intermedio. La zona centrale è formata da vacuoli grassi, cellule stromali, granulociti e numerose cellule distrutte. La zona esterna contiene una grande quantità di sangue, che diluisce le cellule del midollo osseo. Come gli strisci sottili, contribuisce solo allo studio dei dettagli morfologici delle cellule mieloidi e degli eritrociti. La massa cellulare più densa si trova nella zona intermedia, il che consente uno studio ottimale in grado di chiarire tutte le domande che sono state delineate. Qui le cellule del midollo sono ben conservate e disposte in isolotti o nidi, proprio come si vede nel midollo. Pur mantenendo la topografia del midollo osseo, i risultati dello studio di questa zona sono più omogenei e corrispondono allo stato attuale del midollo osseo, che è confermato dal confronto con le sue immagini istologiche. La determinazione semiquantitativa della densità cellulare è espressa come: a) normale, b) ricca o c) magra rispetto al midollo osseo normale. L'identificazione di una massa cellulare normale o abbondante è un reperto prezioso, mentre il midollo osseo scarso dovrebbe essere considerato con cautela. Per provare la presenza di una vera e propria ipoplasia, devono essere esaminate diverse placche, una puntura in diverse aree ossee e/o una biopsia ossea. Le informazioni più accurate sulla massa cellulare del midollo osseo si ottengono esaminando sezioni istologiche. In un adulto, il rapporto tra lo spazio occupato dal grasso e il parenchima a cellule attive è normalmente 1:1 o 2:1. Alcuni autori considerano il midollo osseo ipocellulare quando le cellule ematopoietiche occupano meno di un quarto dei grumi del midollo osseo. Un esame qualitativo del midollo osseo è essenziale per fare una diagnosi. Si effettua, per immersione, sia su strisci sottili che, in particolare, su strisci con grumi schiacciati della zona intermedia. Si raccomanda la selezione degli strisci meglio stirati e colorati con cellule chiaramente definite e morfologicamente ben conservate. Questo studio delinea: a) identificazione di diversi tipi di cellule mieloidi; b) determinazione del grado di maturazione di ciascuna fila cellulare; c) chiarimento del rapporto tra granulociti ed eritroblasti (G/E) d) identificazione di cellule in fase di mitosi; e) descrizione delle cellule atipiche incontrate. Dopo aver esaminato diversi strisci, viene compilato o un "mielogramma" descrittivo dettagliato (contenente le conclusioni tratte dopo aver decifrato gli strisci), oppure un mielogramma in termini percentuali, stabilito da almeno 300-500 elementi. Esistono due modi per compilare un mielogramma percentuale: 1) assegnando le restanti righe cellulari a 100 granulociti; 2) visualizzazione percentuale di ciascun tipo di cellule rispetto al numero totale di cellule del midollo osseo. Da un punto di vista statistico, quest'ultimo metodo sembra essere più corretto e rispecchia apparentemente il quadro reale della composizione cellulare del midollo osseo. Le formule stabilite dai singoli autori differiscono notevolmente, poiché è difficile determinare i valori medi reali in un tessuto così eterogeneo come il midollo osseo. La tabella mostra, secondo Wintrobe, i risultati dello studio di campioni selezionati di midollo osseo da 12 individui normali. Mielogramma normale

Parametri del mielogramma Valore medio (%) Intervallo di fluttuazioni (%)

Cellule reticolari 0,9 0,1-1,6 Blasti indifferenziati 0,6 0,1-1,1 Mieloblasti 1,0 0,2-1,7

Promielociti 2,5 1,0-4,1

Neutrofili dei mielociti 9,6 7,0-12,2 Neutrofili dei metamielociti 11,5 8,0-15,0 Neutrofili da taglio 18,2 12,8-23,7 Neutrofili segmentati 18,6 13,1-24,1 Totale cellule dei neutrofili 60,8 52,7-68,9 Mielociti eosinofili 0,1 0,0-0,2 Metamielociti eosinofili 0,2 0,1-0,4 Eosinofili 2,8 0,4-5,2

Cellule totali della serie eosinofila 3,2 0,5-5,8 Mielociti basofili 0,1 0-0,3

Basofili 0,1 0-0,3

Cellule totali della serie basofila 0,2 0-0,5 Linfoblasti 0,1 0-0,2

Prolinfociti 0,1 0-0,2

Linfociti 8.8 4.3-13.3

Cellule linfoidi totali 9,0 4,3-13,7 Monoblasti 0,1 0-0,2

Monociti 1,9 0,7-3,1

Plasmablasti 0,1 0-0,2

Proplasmociti 0,1 0,1-0,2

Plasmacellule 0,9 0,1-1,8

Eritroblasti 0,6 0,2-1,1

normoblasti basofili 3,6 1,4-5,8 normoblasti policromatofili 12,9 8,9-16,9 normoblasti ossifili 3,2 0,8-5,6

Cellule eritroidi totali 20,5 14,5-26,5 Megacariociti 0,4 0,2-0,6

Secondo i nostri studi sulle persone sane, i risultati sono i seguenti:

un numero di granulociti 56-70%,

serie eritroblastica 23-30%, serie linfoplasmocitica 5-10%, serie monocito-macrofagi 1-2% e serie megacariociti 0,1-0,8% (Ursya). Un cambiamento nella proporzione di file mieloidi normali o la loro sostituzione con cellule anormali suggerisce spesso il tipo di malattia. Le cellule reticolari compaiono meno frequentemente e, inoltre, in piccolo numero. Quasi per caso, gli strisci (o le impronte del midollo osseo) mostrano osteoblasti e/o osteoclasti, che non devono essere confusi con cellule neoplastiche. La loro presenza si osserva più spesso nei bambini, meno frequentemente negli adulti con mielofibrosi primaria o secondariamente, dopo metastasi carcinomatose, con leucemia acuta, osteoporosi, ecc. Il rapporto G/E si ottiene dividendo i granulociti per il numero degli eritroblasti. In un adulto normale, questo rapporto è in media di 3/1 o 4/1, con limiti stimati a 2/1 (quando sono inclusi solo i granulociti immaturi) e 5/1 (quando riguarda tutti i granulociti - maturi e immaturi). Il rapporto H/E varia con l'età: alla nascita è piccolo (1,8/1), a 2 settimane di età sale a 11/1, poi diminuisce gradualmente, e nei bambini di un anno raggiunge i valori di un adulto. Il rapporto H/E è normale nei casi di ipo- o iperplasia midollare globale, nonché nella proliferazione di singole cellule che non sono incluse nel calcolo di questo rapporto, ad esempio nel plasmocitoma. Nelle leucemie, nelle reazioni simil-leucoma e nelle eritroblastopenie, il rapporto è alto, mentre nelle anemie con iperplasia eritroblastica è basso o inverso (anemie megaloblastiche, emolitiche). Prima del rilascio dei dati del mielogramma ottenuti dopo lo studio degli strisci, è necessario chiarire: a) il sito della puntura; b) densità ossea; c) le condizioni in cui è avvenuta l'aspirazione; d) l'aspetto macroscopico del materiale selezionato. L'esame del midollo osseo è un processo complesso basato sull'integrazione di numerosi e vari dati. Il suo risultato dovrebbe riflettere conclusioni generali, basate più sull'inferenza che sulla registrazione meccanica delle singole figure, che peraltro fluttuano. La conclusione di qualsiasi mielogramma dovrebbe chiarire la diagnosi o le indicazioni per ulteriori studi derivanti dallo studio del midollo osseo. Nelle malattie del sangue, la puntura di aspirazione aiuta a chiarire la diagnosi con l'aiuto di strisci e sezioni con grumi nell'80% dei casi. In altri casi sono indicati la biopsia ossea e l'esame istologico del midollo osseo. La selezione bioottica e l'esame istologico sembrano necessari per: a) mielofibrosi primaria o secondaria; b) aplasia o ipoplasia del midollo osseo; c) malattie che si manifestano con lesioni di tipo granulomatoso (es. , morbo di Godgkin, sarcoidosi, tubercolosi, ecc.); d) metastasi carcinomatose; e) in tutti i casi in cui il materiale selezionato per puntura non è soddisfacente o l'aspetto del midollo osseo non è convincente. Dopo il campionamento bioottico, le impronte vengono preparate per l'esame citologico, poiché le sezioni istologiche forniscono poche informazioni sui dettagli strutturali delle cellule ematopoietiche che sono affollate, non sparse e non standardizzate. Inoltre, la fissazione provoca la retrazione cellulare e la colorazione istologica è meno selettiva della colorazione citologica. Ecco perché un esame completo del midollo osseo coinvolge sia citologico - su strisci o impronte, sia istologico - su sezioni dello studio. Va ricordato che le metodiche citologiche e istologiche di esame del midollo osseo non sono escluse, ma, al contrario, sono complementari: una biopsia è un metodo quantitativo e architettonico, mentre un mielogramma è qualitativo e citologico.

Metodo per contare i globuli nella camera di Goryaev.

La camera di Goryaev - un dispositivo progettato per contare il numero di cellule in un dato volume di liquido. Di solito viene utilizzato per determinare il numero di elementi formati in un campione di sangue. Le camere sono costituite da uno spesso vetrino a cui sono applicati tagli trasversali, che formano tre aree piane disposte trasversalmente. La piattaforma centrale è divisa da una fessura longitudinale in due, ciascuna delle quali ha una griglia incisa su di essa. Su entrambi i lati della piattaforma centrale nella camera di Goryaev ce ne sono altre due 0,1 mm più alte (nella camera Fuchs-Rosenthal 0,2 mm) più alte di quella centrale. I piani di questi siti servono a macinare il vetrino fino a quando non compaiono i cosiddetti anelli newtoniani. Dopo aver strofinato il vetro di copertura, si crea una camera, chiusa su due lati, e sugli altri due sono presenti delle lacune (spazi capillari) attraverso le quali viene riempita la camera. Il principio della griglia è lo stesso. Sono divisi in uno o nell'altro numero di quadrati, raggruppati in vari modi. Un valore costante in tutte le griglie è il cosiddetto "quadratino", il cui lato è 1/20 mm, quindi la sua area è 1/400 mm2. Utilizzando la fotocamera Goryaev, è anche possibile determinare l'ingrandimento del microscopio. Esternamente, è un parallelepipedo trasparente (vetrino), con scanalature e una griglia microscopica applicata. Le dimensioni delle piccole divisioni della cella della griglia sono 0,05 mm e le grandi divisioni sono 0,2 mm. In questo caso, la griglia viene applicata ad una piattaforma (sezione di vetro) posta 0,1 mm più in basso rispetto a due piattaforme adiacenti. Queste aree vengono utilizzate per lappare il vetrino coprioggetto. Di conseguenza, il volume di liquido sopra il quadrato formato dalle grandi divisioni della griglia di Goryaev è di 0,004 microlitri. Contando il numero di celle su un grande quadrato, puoi calcolare la densità di un determinato tipo di cella in sospensione usando la formula: Numero di celle/ml = numero di celle sopra il quadrato grande * 2,5 10^5 Usando la fotocamera Goryaev come una sorta di standard, puoi determinare l'ingrandimento del microscopio con la formula: Kg=(m2-m1)/(a*N) dove kgè l'ingrandimento del microscopio; m 1 - posizione del bordo sinistro della cella della camera di Goryaev; m 2 - posizione del bordo destro di una cella o gruppo di celle; N- il numero di celle tra i confini misurati; un- la dimensione cellulare della camera di Goryaev (pari a 0,05 mm). La camera di Goryaev viene utilizzata anche per contare il numero di cellule in coltura. La formula per contare i globuli nella camera di Goryaev è: x = (a 400 c) / b, dove x è il numero desiderato di elementi sagomati in 1 mm3; a - la somma degli elementi sagomati contati in un certo volume della camera; b - il numero di quadratini contati; c - diluizione del sangue.

Metodo per il conteggio delle oocisti nella camera di Goryaev. Questo metodo viene solitamente utilizzato quando si infettano sperimentalmente animali con una quantità di oocisti determinata con precisione (nell'animale viene iniettata una quantità adeguata di millilitri di sospensione). 1 ml di sospensione contenente oocisti viene posto nella camera di Goryaev. Poiché il volume della camera di Goryaev è 0,9 m3, il numero di oocisti contate viene moltiplicato per 1111. Il numero risultante è adeguato al numero di oocisti in 1 cm3 di soluzione. Per una determinazione più accurata, i calcoli devono essere eseguiti almeno tre volte, quindi si deve ricavare il valore medio aritmetico. Il numero di oocisti necessarie per l'infezione viene misurato utilizzando una pipetta graduata. Per una distribuzione più uniforme delle oocisti nel mezzo di incubazione, il contenuto della provetta deve essere agitato ripetutamente.

Conteggio degli eritrociti nella camera di Goryaev Principio. La quantità esatta di sangue viene miscelata uniformemente in una certa quantità di liquido e posta in una camera di volume noto in cui la sospensione di sangue è distribuita in un unico strato. Il fondo della camera è rappresentato graficamente, il che consente di contare con precisione gli eritrociti. Reagenti: soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%. Equipaggiamento speciale: microscopio, fotocamera di Goryaev, provette di laboratorio o un capillare dell'emometro di Saly. Avanzamento di definizione. Aggiungere 8 ml di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% e 0,02 ml di sangue in una provetta asciutta e pulita. La punta della pipetta viene preliminarmente pulita, il sangue viene soffiato sul fondo della provetta e la pipetta viene accuratamente lavata con lo strato superiore del liquido. Mescolare bene il contenuto della provetta. Si ottiene una diluizione del sangue di 1:400, cioè il sangue viene diluito 400 volte. Con l'ispessimento del sangue, è consigliabile diluirlo di 500, 600, 700, 800 volte. La camera e il vetrino coprioggetto devono essere lavati e asciugati. Il vetrino coprioggetto viene strofinato contro la camera in modo che appaiano anelli iridescenti. Prendere una goccia di sangue diluito dalla provetta e riempire la camera con essa, applicandola al bordo del vetrino.Gli eritrociti vengono contati 1 minuto dopo aver riempito la camera al microscopio a basso ingrandimento (obiettivo x8, oculare x10 o x15) con un diaframma coperto o un condensatore abbassato (in un campo visivo oscurato) . Gli eritrociti vengono contati in cinque quadrati grandi (o 80 piccoli) disposti in diagonale. Vengono presi in considerazione gli eritrociti che giacciono all'interno della piazzetta, così come sulle sue pareti sinistra e superiore. Le celle che si trovano sulla riga destra e inferiore del quadrato non contano. Calcolo: Il numero calcolato di cellule in 80 quadratini viene moltiplicato per 20.000 con una diluizione del sangue di 1: 400, per 25.000 con una diluizione di 1: 500 o per 30.000 con una diluizione di 1: 600 e si ottiene il risultato finale in milioni per 1 ml. In questo caso, si presume che il volume di un quadratino sia 1/4000 μl. Per contare le cellule in 1 litro, anche il numero di globuli rossi in 1 ml viene moltiplicato per 1.000.000. Nota. Non è consentito studiare il sangue con i coaguli; conta cellulare subito dopo aver riempito la camera (senza attendere 1 min); l'uso di pipette e provette scarsamente lavate e asciugate, reagenti di scarsa qualità che causano emolisi. Fatte salve tutte le regole di calcolo, l'errore sarà in media di ± 2,5%.

Regole di disinfezione Dopo l'uso, la fotocamera Goryaev deve essere disinfettata Soluzione al 3%. acqua ossigenata, sciacquare con acqua distillata e asciugare con un panno morbido. Conservare la fotocamera in un luogo asciutto.

Metodo di lavoro sugli analizzatori ematologici.

Analizzatore-ematologico- un dispositivo (un insieme di apparecchiature) progettato per la ricerca quantitativa cellule sangue nei laboratori diagnostici clinici. Può essere automatico o semiautomatico. Un analizzatore ematologico semiautomatico differisce da uno automatico in quanto il processo di diluizione di un campione di sangue viene eseguito da un dispositivo separato: un diluitore. Dopo aver preparato la diluizione del sangue intero, l'operatore deve trasferire il campione diluito nel modulo di misurazione. Attualmente, gli analizzatori semiautomatici non vengono praticamente prodotti.

L'Analizzatore Ematologico Automatico è uno strumento completamente automatizzato in cui l'intero processo analitico viene eseguito automaticamente.

I moderni analizzatori automatici sono in grado di elaborare decine di campioni (da 60 a 120) all'ora, con accuratezza e riproducibilità secondo le specifiche, nonché di archiviare i risultati dei test nella memoria interna e, se necessario, di stamparli sulla stampante termica o una stampante esterna.

I moderni analizzatori ematologici sono classificati in base alla nomenclatura degli indicatori determinati dei globuli.

Analizzatori ematologici a otto parametri determinare i seguenti parametri: concentrazione eritrociti(RBC) leucociti(WBC) piastrine(pl) emoglobina(Hb), nonché i seguenti parametri eritrocitari: volume medio eritrocitario (MCV), contenuto medio di emoglobina eritrocitaria (MCH), concentrazione media di emoglobina eritrocitaria (MCHC), ematocrito(Hct).

Al momento non vengono praticamente prodotti analizzatori ematologici a otto parametri.

Analizzatori ematologici classe 3-diff. Gli analizzatori ematologici di classe 3-dif, a seconda del modello prodotto, consentono di determinare da 16 a 22 indicatori di cellule del sangue. Gli analizzatori di questa classe, oltre a quei parametri che determinano gli analizzatori a otto parametri, determinano tre sottopopolazioni di leucociti: la concentrazione di linfociti (Lm), granulociti (Gr) e i cosiddetti leucociti medi (Mid), nonché la loro percentuale Lm%, Gr% e Mid%. Da qui il nome della classe 3-dif. Inoltre, gli analizzatori ematologici di questa classe determinano il coefficiente di variazione del volume eritrocitario (RDW) e una serie di indicatori che caratterizzano le piastrine: il volume piastrinico medio (MPV), la frazione di volume piastrinico (Tct) (analogo all'ematocrito), il coefficiente di variazione del volume piastrinico (PDW).

Importanti informazioni diagnostiche, che possono essere ottenute dagli analizzatori ematologici di questa classe, sono le funzioni di distribuzione in volume di eritrociti, leucociti e piastrine - istogrammi.

Analizzatori ematologici classe 5-dif. La principale differenza tra gli analizzatori ematologici 5-dif e gli analizzatori 3-dif è la loro capacità di rilevare tutte e 5 le sottopopolazioni di leucociti: linfociti (Lym), monociti (Mon), neutrofili (Neu), basofili (Bas) ed eosinofili (Eos), così come il loro contenuto percentuale di Lym%, Mon%, Neu%, Bas% ed Eos%. Il metodo di conteggio dell'impedenza, noto anche come Contatore Coulter, utilizzato negli analizzatori 3-dif, non è in grado di distinguere tra neutrofili, basofili ed eosinofili, pertanto negli analizzatori 5-dif viene utilizzato un metodo diverso di differenziazione cellulare. Si basa sul principio diffrazione radiazione laser su cellule leucocitarie e ulteriore analisi della radiazione diffusa. I leucociti "medi" non differiscono in dimensioni sufficienti per essere distinti dal metodo dell'impedenza, ma hanno una struttura interna diversa e interagiscono in modo diverso con i coloranti. E il metodo per rilevare un pattern di diffrazione risulta essere sensibile alla struttura interna delle cellule. Pertanto, gli eritrociti e le piastrine vengono contati da un contatore Coulter e i leucociti da un'unità laser separata.

Lavoro 8. Determinazione quantitativa delle proteine ​​nel siero del sangue

4. Composizione e proprietà delle proteine ​​complesse

Lavoro 9. Natura chimica delle emproteine

Lavoro 10. Identificazione della componente carboidrata delle glicoproteine

Lavoro 11. Reazioni qualitative alle fosfoproteine

Lavoro 12. Determinazione quantitativa del contenuto di acidi sialici nel siero sanguigno con il metodo di Hess

Lavoro 13. Natura chimica delle nucleoproteine

Acidi nucleici

1. Studio della natura chimica degli acidi nucleici

Lavoro 14. Reazioni qualitative ai componenti dell'acido nucleico

Metodi quantitativi per la determinazione degli acidi nucleici

Lavoro 15. Metodo spettrofotometrico per la determinazione quantitativa degli acidi nucleici secondo A.S. Spirin

Lavoro 16. Metodi fotocolorimetrici per la determinazione quantitativa degli acidi nucleici

Lavoro 17. Studio dei fosfolipidi

Lavoro 18. Reazioni qualitative agli steroidi

Enzimi

Azione comparativa di enzimi e catalizzatori non biologici

Lavoro 19. Confronto dell'azione dell'α-amilasi della saliva e dell'acido cloridrico sulla reazione dell'idrolisi dell'amido

2. Identificazione di enzimi appartenenti a classi diverse

Lavoro 20. Rilevazione di ossidoreduttasi in materiale biologico

Lavoro 21. Rilevazione della colinesterasi

In siero di sangue dal metodo espresso di Herzfeld e Stumpf

Lavoro 22. Determinazione dell'attività della fruttosio-1,6-bisfosfato aldolasi nel siero del sangue secondo il metodo di V.I. Tovarnitsky e E.N. Voluyskaya

Costruzione di un grafico di calibrazione

Lavoro 23. Determinazione della glucosio fosfato isomerasi

Nel siero del sangue

3. Studio delle proprietà cinetiche degli enzimi

Lavoro 24. Cinetica delle reazioni enzimatiche sull'esempio dell'α-amilasi della saliva

4. Specificità dell'azione enzimatica

Lavoro 25. Dimostrazione della specificità assoluta del substrato

5. Modificatori di attività enzimatica

Lavoro 27. Attivatori e inibitori dell'α-amilasi salivare

tessuto muscolare

Lavoro 29. Inibizione non competitiva della catalasi ematica

6. Quantificazione dell'attività enzimatica

Lavoro 30. Studio quantitativo dell'attività della droga lattato deidrogenasi secondo Kornberg

Lavoro 31. Metodo fotocolorimetrico per studiare l'attività della lattato deidrogenasi nel siero del sangue secondo Sevel e Tovarek

Lavoro 32. Determinazione dell'attività della fosfatasi alcalina nel siero del sangue secondo Bodansky

7. Studio degli isoenzimi

Lavoro 33. Separazione degli isoenzimi della lattato deidrogenasi dal siero del sangue mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide secondo Dietz e Lubrano

Lavoro 34. Determinazione dell'attività della γ-glutamiltransferasi nel siero del sangue

Biochimica della digestione

Lavoro 35. Studio delle componenti acide del succo gastrico

Lavoro 36. Determinazione dell'acidità del succo gastrico con il kit diagnostico "Acidotest"

Lavoro 37. Idrolisi proteica da parte di enzimi del tubo digerente

Lavoro 38. Studio della dinamica dell'idrolisi dei triacilgliceroli sotto l'azione della lipasi pancreatica

Scambio di energia (bioenergia)

1. Studio dei processi di ossidazione biologica nei tessuti animali. Lavoro 39. Rilevazione della citocromo ossidasi nel tessuto muscolare

Lavoro 40. Dimostrazione del processo di fosforilazione ossidativa e dell'azione dei disaccoppianti su di esso

Lavoro 41. Rilevazione della glicolisi nel tessuto muscolare

Lavoro 42. Analisi di nucleotidi di adenina mediante cromatografia su strato sottile a scambio ionico

Lavoro 43. Determinazione dell'attività della creatinfosfochinasi nel siero del sangue secondo Ennor e Rosenberg

Analisi dei pigmenti e dei processi ossidativi di organismi fotosintetici

Lavoro 44. Reazioni qualitative ai pigmenti vegetali

Lavoro 45. Determinazione dell'attività della perossidasi nel materiale vegetale secondo il metodo di A.N. Boyarkin

Metabolismo dei carboidrati

Lavoro 46. Determinazione del glucosio nel sangue

Lavoro 47. Determinazione quantitativa del glucosio nel sangue con il metodo della glucosio ossidasi

Lavoro 48. Determinazione del contenuto di acido lattico nel sangue secondo Barker e Summerson

Lavoro 49. Determinazione del contenuto di acido piruvico nel sangue secondo Friedemann e Haugen

metabolismo lipidico

Lavoro 50

Lavoro 51

Lavoro 52. Determinazione del colesterolo nel siero del sangue secondo il metodo di Ilk

Lavoro 53. Determinazione del contenuto di fosfolipidi totali nel siero sanguigno

Lavoro 54. Separazione dei lipidi sierici del sangue mediante cromatografia su strato sottile

Metabolismo delle proteine ​​e degli aminoacidi

Lavoro 55. Determinazione del contenuto di frazioni proteiche di siero sanguigno mediante metodo turbidimetrico

Lavoro 56. Determinazione dell'attività delle catepsine nel siero del sangue secondo A.A. Pokrovsky, A.I. Archakov e O.N.

catepsine

Lavoro 57. Determinazione dell'attività dell'aspartato e dell'alanina aminotransferasi nel siero del sangue secondo Reitman e Frenkel

Lavoro 58. Determinazione dell'attività dell'istidasi nel siero del sangue secondo Tabor e Mehler, modificato da V.A.

Lavoro 59. Determinazione del contenuto di idrossiprolina libera nelle urine secondo Neumann e Logan, modificato da p.

Metabolismo delle sostanze non proteiche contenenti azoto

1. Studio dei comuni prodotti del metabolismo dell'azoto

Lavoro 60. Determinazione quantitativa dell'azoto residuo nel sangue mediante metodo fotocolorimetrico

Lavoro 61. Determinazione quantitativa dell'urea nel siero del sangue e nelle urine

Lavoro 62. Determinazione quantitativa di creatina e creatinina con il metodo di Brown

2. Studio dello scambio di acidi nucleici e nucleotidi

Lavoro 63. Determinazione dell'attività della desossiribonucleasi acida (dnCase) nel siero del sangue secondo A.A.

Lavoro 64. Determinazione del contenuto di acido urico nel siero del sangue secondo il metodo di Muller e Seifert

3. Studio del metabolismo della porfirina (pigmento).

Lavoro 65. Determinazione della bilirubina e delle sue frazioni nel siero del sangue secondo Yendrashik, Cleghorn e Grof

Patologia molecolare

1. Diagnostica rapida della patologia del metabolismo degli aminoacidi Lavoro 66. Rilevazione dell'iperaminoaciduria

Lavoro 67. Metodi espressi per diagnosticare la fenilchetonuria

Lavoro 68. Diagnosi di tirosinosi Millon test per la tirosina

Lavoro 69. Rilevazione di alcaptonuria mediante un test per l'acido omogentisico

Lavoro 70

2. Diagnostica rapida delle patologie del metabolismo dei carboidrati Lavoro 71. Rilevazione della pentosuria mediante test di Bial

Lavoro 72. Rilevazione di fruttosuria mediante il test di Selivanov

Lavoro 73. Rilevazione delle mucopolisaccaridosi mediante test con blu di toluidina per mucopolisaccaridi

Lavoro 74. Determinazione del contenuto di porfobilinogeno nelle urine

Lavoro 75. Determinazione quantitativa del contenuto di acido delta-aminolevulinico nelle urine

Lavoro 76

Regolatori metabolici

1. Studio delle vitamine Lavoro 77. Reazioni qualitative alle vitamine

Lavoro 78. Determinazione del contenuto di tiamina e riboflavina con il metodo fluorimetrico nei preparati multivitaminici

Lavoro 79. Determinazione quantitativa dell'acido ascorbico nelle piante medicinali

2. Studi di ormoni, mediatori e loro metaboliti

Lavoro 80. Reazioni qualitative agli ormoni proteico-peptidi.

Lavoro 81. Reazioni qualitative agli ormoni - derivati ​​degli amminoacidi

Lavoro 82. Reazioni qualitative agli ormoni steroidei e ai loro metaboliti

Lavoro 83. Regolazione dei livelli di insulina e adrenalina del glucosio nel sangue degli animali

Lavoro 84. Determinazione quantitativa dell'istamina nel sangue con n-nitroanilina diazotizzata secondo N.V. Klimkina e S.I. Plitman

Studio dei fluidi biologici

1. Analisi del sangue biochimiche Lavoro 85. Determinazione del contenuto di emoglobina nel sangue mediante il suo assorbimento di luce

Lavoro 86. Determinazione del contenuto di emoglobina fetale negli eritrociti umani

Lavoro 87. Determinazione del contenuto di emoglobina glicosilata negli eritrociti mediante metodo fotocolorimetrico

Lavoro 88. Determinazione della concentrazione di aptoglobine nel siero del sangue mediante metodo fotocolorimetrico

Lavoro 89

Lavoro 90. ​​Determinazione dell'attività dell'α-amilasi nel siero del sangue mediante metodo amiloclastico

Lavoro 91. Determinazione del contenuto di calcio nel siero del sangue con il metodo murexide

Lavoro 92. Test del timolo secondo Huergo e Popper

Lavoro 93. Reazione sublimato-sedimentaria

Lavoro 94. Determinazione quantitativa del contenuto di ferro nel siero del sangue

2. Studio biochimico delle urine

Lavoro 95. Studio delle proprietà fisico-chimiche dell'urina

Lavoro 96. Determinazione dei corpi chetonici e del glucosio nelle urine

Lavoro 97. Determinazione delle proteine ​​nelle urine con il metodo Brandenberg-Roberts-Stolnikov

Lavoro 98. Determinazione qualitativa di indican nelle urine

Lavoro 99. Rilevazione di alcuni pigmenti nelle urine.

Metabolismo degli xenobiotici

Studio dei processi di ossidazione e coniugazione di xenobiotici Lavoro 100. Rivelando l'attività respiratoria dei microsomi

Lavoro 101. Studio della n-demetilazione ossidativa nei microsomi epatici secondo l'Our

Lavoro 102. Determinazione dell'attività idrossilasica dei microsomi epatici secondo Kato e Gilet

Lavoro 103

Lavoro 104. Determinazione dell'attività dell'alcol deidrogenasi nel siero del sangue secondo Shkursky et al.

Lavoro 105

Lavoro 106. Rilevazione dell'acetilazione (inattivazione) dell'acido isonicotinico idrazide (gink) nel corpo

Studio della perossidazione lipidica di membrane biologiche

Lavoro 107. Determinazione della sensibilità degli eritrociti all'emolisi del perossido

Lavoro 108. Determinazione del tasso di perossidazione lipidica nelle biomembrane

Applicazione

2.Indicatori biochimici del plasma sanguigno

1. Norme cliniche generali

2. Esame speciale delle urine

Succo gastrico

2. Tampone fosfato (0,1 m, pH 5,8-8,0)

3. Tampone Tris (0,1 m, pH 7,1-9,2)

4. Tampone acetato (0,2 m, pH 3,6-5,8)

5. Tampone glicina (0,05 m, pH 8,6-10,6)

3. Preparazione di alcuni reagenti

Sommario

2. Tampone fosfato (0,1 m, pH 5,8-8,0)

Na 2 HPO 4 0,2 M, ml	Na 2 H 2 PO 4 0,2 M, ml

3. Tampone Tris (0,1 m, pH 7,1-9,2)

In un matraccio tarato da 1 l (in 500 ml di H 2 O) si sciolgono 24,2 g di tris-(idrossimetil)amminometano. Per ottenere il valore di pH desiderato si aggiunge il volume di 1 M HCl indicato in tabella e si porta il volume a 1000 ml con acqua distillata.

4. Tampone acetato (0,2 m, pH 3,6-5,8)

Sodio acetato 0,2 M, ml	Acido acetico 0,2 M, ml		Sodio acetato 0,2 M, ml	Acido acetico 0,2 M, ml

5. Tampone glicina (0,05 m, pH 8,6-10,6)

I volumi indicati di glicina e idrossido di sodio vengono miscelati e il volume viene regolato con acqua distillata a 200 ml.

	Glicina 0,2 M, ml	NaOH 0,2 M, ml		Glicina 0,2 M, ml	NaOH 0,2 M, ml

3. Preparazione di alcuni reagenti

Soluzione attivante. 155 mg di glutatione ridotto e 400 mg di albumina cristallina vengono posti in un matraccio tarato della capacità di 100 ml, si sciolgono in 50 ml di acqua distillata e si porta il pH a 8,2 utilizzando una soluzione 1 M di NaOH. Quindi aggiungere acqua fino al segno.

Soluzione di ammoniaca di nitrato d'argento. Una soluzione concentrata di ammoniaca viene aggiunta a una soluzione al 2-3% di argento fino a quando il precipitato non si dissolve.

Tampone acetato pH 3,6. Preparare mescolando 463 ml di soluzione A e 37 ml di soluzione B, diluire fino al segno con acqua in un matraccio tarato fino a 1 litro. Soluzione A: Diluire 11,55 ml di acido acetico glaciale con acqua in un matraccio tarato da 1 litro. Soluzione B: Sciogliere 27,2 g di acetato di sodio in acqua in un matraccio da 1 litro.

Reagente biureto (reagente di Benedetto). 173 g di citrato di sodio e 100 g di carbonato di sodio vengono sciolti in 300 ml di acqua distillata a bagnomaria. Separatamente, 17,3 g di solfato di rame vengono sciolti in 300 ml di acqua. Entrambe le soluzioni vengono drenate e il volume totale viene portato a 1 litro.

soluzione tampone. 2,76 g di Veronal e 2,06 g di Medinal vengono sciolti in 1 litro di acqua distillata. Conservare in frigorifero; se compare un precipitato, la soluzione non è adatta all'uso.

sospensione del carbone. 0,25 g di carbone attivo vengono posti in un matraccio tarato da 100 ml e diluiti con tampone acetato pH 3,6. Agitare bene prima dell'uso.

Reagente riducente. Soluzione all'1% di acido ascorbico preparata con una soluzione di solfato di rame allo 0,016%.

Emoglobina, soluzione al 4% in tampone acetato (pH 4,0). In primo luogo, una soluzione di emoglobina all'8% viene preparata in una soluzione di urea 8 mol/l, mantenuta per 2 ore in un termostato a 60°C e diluita 2 volte con tampone acetato prima dell'uso.

Glicil-glicina. 0,55 mmol/l, pH 8,3. 3,63 g di glicil-glicina vengono posti in un matraccio tarato da 50 ml, rabboccato con acqua fino al segno (soluzione tampone).

Soluzione denaturante

Reagente diazoico per la determinazione della bilirubina. Preparare due soluzioni. Prima soluzione: si sciolgono 3 g di acido sulfanilico in 500 ml di acqua distillata, si aggiungono 15 ml di acido cloridrico concentrato (in un bagno caldo), si regola il volume a 1 litro con acqua. Seconda soluzione: soluzione acquosa di nitrito di sodio allo 0,5%. Prima dell'uso, mescolare 5 ml della prima soluzione e 0,25 ml della seconda.

Diacetile, soluzione funzionante. 1 ml di diacetile viene diluito con acqua distillata in un matraccio tarato da 100 ml (la soluzione viene conservata in frigorifero). La soluzione di lavoro di diacetile viene preparata prima dell'uso aggiungendo 24 ml di acqua distillata a 1 ml della soluzione madre di diacetile.

Reagente difenilamminico. 1 g di difenilammina viene sciolto in 100 ml di acido acetico glaciale. Alla soluzione si aggiungono 2,75 ml di acido solforico concentrato.

Soluzione di calibrazione. Base - 0,75 mmol/l ALA (100 µg/ml) in termini di base: 0,00635 g di ALA cloridrato vengono sciolti in tampone acetato pH 3,6 in un matraccio tarato da 50 ml. Conservare in frigorifero per non più di un mese. Una soluzione di calibrazione funzionante viene preparata dalla soluzione principale, 1 μg / ml. Preparare prima dell'uso diluendo la soluzione madre con tampone acetato 100 volte.

Soluzione di calibrazione. 22,5 mg di diidrossiacetone vengono sciolti in 25 ml di acqua riscaldando. 1 ml di questa soluzione contiene 10 μmoli di diidrossiacetone. Una soluzione di calibrazione di diidrossiacetone viene versata in un certo numero di provette (vedi lavoro), rabboccata fino al volume richiesto, quindi la reazione viene eseguita allo stesso modo della determinazione dell'attività dell'enzima.

Calibrazione (standard) soluzione di ferro (30 µmol/l).

Per prima cosa si preparano i sali di Mora.

reagente alla caffeina. 1 g di caffeina pura, 7,5 g di sodio benzoato, 12,5 g di sodio acetato vengono sciolti in 90 ml di acqua distillata, riscaldati a 50-60°C, agitati, raffreddati e portati a 100 ml con acqua distillata.

Molibdato di ammonio in acido nitrico. Si sciolgono 7,5 g di molibdato di ammonio in 100 ml di acqua e si aggiungono 100 ml di acido nitrico al 32%.

Urina per alcaptonuria. In assenza di patologie patologiche, l'idrochinone viene aggiunto alle urine normali in ragione di 20 g/l.

Urina con iperaminoaciduria. In assenza di glicina patologica viene aggiunta all'urina normale in ragione di 1,0 g/l.

Urina con mucopolisaccaridosi. In assenza di patologie patologiche, la consuride o l'eparina vengono aggiunte alle urine normali in ragione di 0,05-0,1 g / l.

Urina con pentosuria. In assenza di sostanze patologiche, si aggiunge alle urine xilulosio o ribosio in ragione di 1,0 g/l.

Urina con tirosinosi. In assenza di patologie patologiche, la tirosina viene aggiunta all'urina normale alla velocità di 0,4-0,5 g / l.

Urina con fruttosuria. In assenza di patologie patologiche, il fruttosio viene aggiunto alle urine normali in ragione di 0,3-0,4 g / l.

Urina per cistinuria. In assenza di cistina patologica viene aggiunta all'urina normale in ragione di 0,4-0,5 g / l.

Sodio acetato 3-soluzione acquosa satura. 375 g di acetato di sodio 3-acquoso (o 226 g di sale anidro) vengono sciolti in 250 ml di acqua tiepida, raffreddata a temperatura ambiente. Conservare a temperatura ambiente. La soluzione dovrebbe essere incolore e trasparente.

Sodio fosfato disostituito 0,25 mol/l. Preparare sciogliendo 9,7 g Na 2 HPO 4 ∙12H 2 O o 18 g Na 2 HPO 4 ∙12H 2 O in acqua in un matraccio da 200 ml. Quando si aggiungono 2 ml di questa soluzione a 1 ml di soluzione di acido tricloroacetico, il pH dovrebbe essere compreso tra 5,0 e 6,0.

Soluzione di calibrazione di base di creatinina, 10 mmol/l. 113,1 mg di creatinina vengono portati a 100 ml con una soluzione di acido cloridrico 0,1 mol/l. Quando si costruisce un grafico di calibrazione, una soluzione di lavoro viene preparata dalla soluzione madre diluendo la soluzione madre 100 volte con acqua, 1 ml della soluzione contiene 0,1 mmol di creatinina. Sulla base di ciò, si ottengono un certo numero di provette con le corrispondenti concentrazioni di creatina.

Miscela ossidante per la determinazione della tiamina. A 8 ml di esacianoferrato di potassio all'1% (III) si aggiungono 20 ml di soluzione di NaOH al 30%, mescolare accuratamente. Preparare prima dell'uso.

Reagente Orcino. A 1 g di orcina aggiungere 500 ml di acido cloridrico al 30% (densità 1,15 g / cm 3). Mescolare fino a completa dissoluzione e aggiungere 4-5 ml di soluzione di cloruro di ferro al 10% (III) FeCl 3 . Il reagente è conservato in una bottiglia scura ben chiusa.

Soluzione di calibrazione di base di p-nitroanilina. 0,0829 g di p-nitroanilina vengono posti in un matraccio tarato da 100 ml, portati fino al segno con acqua e sciolti.

Soluzione precipitante. Sciogliere 561 g di solfato di ammonio in 1 litro di acqua distillata e filtrare dopo 24 ore.

Soluzione tampone fosfato basico e sue soluzioni di lavoro n. 1-4. Sciogliere 33,5 g di NaOH in 400 ml di acqua in un matraccio tarato della capacità di 500 ml e aggiungere 226,8 g di KH 2 PO 4 , agitare fino a completo scioglimento, raffreddare e aggiungere acqua fino al segno. Per preparare soluzioni di lavoro di tampone fosfato basico, i seguenti volumi di tampone fosfato basico (in ml) vengono misurati in matracci tarati con una capacità di 100 ml: n. 1 - 92,51; n. 2 - 74,91; N. 3 - 59.18 e N. 4 - 48.68, dopo di che il loro contenuto viene portato al segno con acqua.

Acido picrico, soluzione satura. L'acido picrico delle merci contiene il 15-20% di umidità, non asciugare l'acido. Esplosivo! Sciogliere 2 g di acido picrico in 100 ml di acqua riscaldando in un bagno caldo. Successivamente, la soluzione viene lasciata riposare per 24 ore, mescolando di tanto in tanto. La soluzione viene quindi filtrata. La soluzione è stabile e conservata in un contenitore di vetro scuro.

Tampone pirofosfato 0,05 M pH 8,2. Trasferire 4,46 g di pirofosfato di sodio in un matraccio tarato da 200 ml, scioglierlo in circa 100 ml di acqua, regolare il pH con una soluzione di HCl 0,1 M a 8,2 e rabboccare con acqua distillata fino alla tacca.

Tampone pirofosfato 0,1 M pH 8,5. Trasferire 4,46 g di pirofosfato di sodio in un matraccio tarato della capacità di 100 ml, scioglierlo in 50 ml di acqua, regolare il pH con una soluzione di HCl 0,1 M a 8,5 e aggiungere acqua distillata fino alla tacca.

Reagente di lavoro. Preparare il giorno della determinazione mescolando 30 parti di idrossido di sodio 0,3 N. 2 parti di soluzione di fenolftaleina allo 0,5% e 1 parte di soluzione di solfato di rame allo 0,12%.

Soluzione di acetone cianoidrina. Sciogliere 1 fiala di acetone cianoidrina (0,5 ml - 0,47 g dal kit per la determinazione dell'emoglobina nel sangue) in 1 litro di acqua distillata.

Ferriacetone cianoidrina soluzione. Sciogliere 200 mg di ferricianuro di potassio e 1 fiala (0,5 ml - 0,47 g) di acetone cianoidrina in 1 litro di acqua distillata: è possibile utilizzare da un set di reagenti per preparare una soluzione trasformante per la determinazione dell'emoglobina nel sangue. Stabile per diversi mesi se conservato in un contenitore di vetro scuro a temperatura ambiente.

Soluzione di gluossidasi. Contiene circa 300 unità. in 1 mg. Preparare sciogliendo la quantità adeguata di preparato secco in 10 ml di acqua.

Una soluzione di bato-fenantrolina solfonata. In una provetta si aggiungono 0,5 ml di acido clorosolfonico a 100 mg di batofenantrolina, si scalda a bagnomaria bollente per 30 s, si raffredda e si aggiungono lentamente 10 ml di acqua bidistillata, si scalda nuovamente a bagnomaria per 5 minuti. La miscela viene trasferita in un pallone da 200 ml, si aggiungono 100 ml di acqua, si aggiusta il pH della soluzione a 4-5 N NaOH e si aggiunge acqua ad un volume di 200 ml.

Soluzione di iodio in ioduro di potassio (soluzione di Lugol). Sciogliere 20 g di ioduro di potassio e 10 g di iodio in 100 ml di acqua distillata. Prima dell'uso, la soluzione viene diluita 5 volte.

Soluzione di p-nitrosodimetilanilina (NDMA). Una preparazione NDMA disponibile in commercio viene ricristallizzata da etere etilico. Per misurare l'alcol deidrogenasi, 1 mg di NDMA viene sciolto in 100 ml di tampone pirofosfato 0,1 M (pH 8,5). La soluzione risultante viene filtrata attraverso un filtro di carta e il filtrato viene diluito 2 volte con lo stesso tampone. Conservare a 4°C per due mesi.

Il reagente di Ilka. A 5 parti (in volume) di anidride acetica, aggiungere 1 parte di acido acetico glaciale, quindi versare gradualmente 1 parte di acido solforico concentrato. Conservare il reagente al freddo!

Reagente milionario. (Pronto sotto pressione! ) 40 g di mercurio vengono sciolti in 57 ml di acido nitrico concentrato, prima al freddo, e poi riscaldati a bagnomaria. La soluzione risultante viene diluita con 2 volumi di acqua, lasciata decantare e drenata dal sedimento. Conservare in una bottiglia di vetro scuro.

Reagente di molibdato di ammonio. 2,5 g di molibdato di ammonio vengono sciolti in 60 ml di acqua distillata, filtrata. La soluzione viene aggiunta in un pallone da 100 ml. In un altro pallone si aggiungono 7,5 ml di acido solforico concentrato a 25 ml di acqua distillata. La seconda soluzione viene aggiunta alla prima, raffreddata e diluita fino al segno con acqua distillata. La soluzione è adatta per un mese.

Reagente "NADI". Una soluzione all'1% di dimetil-p-fenilendiammina viene miscelata con un volume uguale di una soluzione all'1% di α-naftolo in alcool e una soluzione di carbonato di sodio all'1,5%. La soluzione è di colore marrone scuro e non dovrebbe avere una sfumatura rosa. Preparato 1 ora prima della lezione.

Reagente Nascia. In un pallone della capacità di 100 ml si aggiungono 15,4 g di acetato di ammonio, 0,3 g di acido acetico glaciale e 0,2 g di acetilacetone, sciolti in acqua distillata e si aggiusta il volume alla tacca.

Reagente di Nessler. In un matraccio tarato della capacità di 500 ml si mescolano e si agitano energicamente per 15 minuti 150 g di ioduro di potassio, 110 g di iodio, 100 ml di acqua distillata e circa 140-150 g di mercurio metallico. In questo caso, la soluzione si riscalda spontaneamente e il colore dovuto allo iodio disciolto diventa gradualmente pallido. La miscela viene quindi raffreddata sotto acqua corrente fino a mantenere un colore rosso distinto, dopodiché il contenuto viene agitato fino a quando il colore rosso diventa verdastro. Dopo la decantazione, il precipitato di mercurio viene accuratamente lavato con acqua. Unire la soluzione e i lavaggi, diluirli con acqua a 2 litri. Prendere 75 ml della soluzione risultante in un matraccio tarato da 0,5 l contenente 75 ml di acqua e 350 ml di soluzione di idrossido di sodio al 10% e diluire con acqua fino al segno.

Reagente di Fehling. Si preparano due soluzioni separatamente. Soluzione 1: Sciogliere 200 g di sale di Rochelle e 150 g di NaOH in un matraccio tarato da 1 L e portare a volume con acqua. Soluzione 2: in un matraccio tarato della capacità di 1 l, sciogliere in acqua 40 g di solfato di rame (II) e portare a volume con acqua. Mescolare volumi uguali di queste soluzioni prima dell'uso.

Reagente di Folin. In un matraccio da 1 litro sciogliere 1 g di tungstato di sodio e 20 g di acido fosfomolibdico in 750 ml di acqua. Chiudere il pallone con un tappo con condensatore a ricadere e, aprendo il flusso dell'acqua in frigorifero, si fa bollire il contenuto per 10 ore; quindi si raffredda, si versa in un matraccio tarato e si porta il volume acquoso del reagente a 1 litro.

Il reagente di Erlich. 0,7 g di p-dimetilamminobenzaldeide vengono sciolti in 150 ml di acido cloridrico concentrato, aggiunti a 100 ml di acqua e miscelati. La soluzione dovrebbe essere incolore o leggermente gialla. Conservare in un contenitore di vetro scuro. Il reagente è stabile.

Il reagente di Erlich. Sciogliere 1 g di p-dimetilamminobenzaldeide in un matraccio tarato da 50 ml in 35 ml di acido acetico glaciale, aggiungere 8 ml di acido perclorico al 57% e portare a volume con acido acetico glaciale. Conservare in un contenitore di vetro scuro in frigorifero per un massimo di una settimana.

Soluzione di alcol timolo (10%). 10 g di timolo purificato vengono sciolti in 100 ml di alcol etilico a 96˚. L'ottenimento del timolo purificato viene effettuato come segue. 100 g di timolo vengono sciolti in 100 ml di alcol etilico a 96˚, filtrati. Aggiungere 1 litro di acqua distillata fredda al filtrato, agitare energicamente e lasciare riposare per 20 minuti. Il filtro viene filtrato e i cristalli rimasti sul filtro vengono lavati due volte con acqua distillata fredda. Asciugare prima su carta da filtro, poi per 2-3 giorni in essiccatore su cloruro di calcio anidro a peso costante.

Soluzione standard. La preparazione di una soluzione standard si effettua miscelando due soluzioni: 1) 0,0962 n soluzione di cloruro di bario: 1,175 g di BaCl 2 ∙2H 2 O cristallino vengono sciolti in 100 ml di acqua in un matraccio tarato. 2) Soluzione di acido solforico 0,2 N. Successivamente si ottiene una sospensione di solfato di bario: in un matraccio tarato da 100 ml si versano 3 ml di una soluzione 0,0962 N di cloruro di bario e si aggiusta il volume con una soluzione 0,2 N di acido solforico ad una temperatura di + 10°C ( a questa temperatura, le dimensioni delle particelle di solfato di bario precipitato danno un risultato relativamente stabile).

Soluzione tampone per substrato: versare 10 ml di acqua in una provetta e aggiungere 0,028 g di L-glutamil-p-nitroanilina e 0,082 g di cloruro di sodio e, senza smettere di mescolare, sciogliere il contenuto della provetta a bagnomaria per 60 secondi . La soluzione viene quindi raffreddata a 37°C e vengono aggiunti 2,5 ml di soluzione tampone. La soluzione di substrato preparata viene conservata a bagnomaria a 37°C durante il funzionamento. La soluzione di substrato non utilizzata può essere conservata in frigorifero per un massimo di una settimana. Il substrato è poco solubile e precipita a temperatura ambiente. Pertanto, prima dell'uso, il substrato cristallizzato viene sciolto riscaldando a bagnomaria bollente. Il riscaldamento e la dissoluzione del supporto possono essere ripetuti non più di due volte.

Soluzione di substrato per la determinazione dell'ALT (soluzione n. 1). Campioni di 29,2 mg di acido α-chetoglutarico e 1,78 g di alanina (0,89 g di α-alanina) vengono pesati su una bilancia analitica e sciolti in una soluzione 1 M di idrossido di sodio fino a completa dissoluzione del precipitato (pH 7,4). La soluzione viene versata in un matraccio da 100 ml e il volume viene regolato con tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4). Aggiungere 1 goccia di cloroformio. La soluzione viene conservata congelata in frigorifero.

Soluzione di substrato per la determinazione dell'AsAT (soluzione n. 2). Su una bilancia analitica vengono pesati campioni di 29,2 mg di acido α-chetoglutarico e 2,66 g di acido α-aspartico (1,33 g di acido α-aspartico). Successivamente, la soluzione viene preparata allo stesso modo della soluzione n. 1.

Soluzione di substrato per la determinazione della glucosio fosfato isomerasi. Si prepara una soluzione tampone di acetato medinale pH 7,4 (9,714 g di acetato di sodio e 14,714 g di medinale vengono sciolti in acqua e il volume viene regolato a 500 ml). Mescolare 8,33 ml di soluzione 0,03 M di sale disodico di glucosio-6-fosfato con 25 ml di tampone acetato mediale; aggiungere alla miscela 25 ml di soluzione di acido cloridrico 0,1 M e diluire a 100 ml con acqua. Mantieni il freddo.

Soluzione di substrato per la determinazione della lattato deidrogenasi. Mescolare 1 ml di soluzione di lattato di sodio 1 M, soluzione di NaCl 9 M, Cl 2 0,05 M, soluzione di NAD 10 g/L. Al contenuto vengono aggiunti 2,5 ml di soluzione tampone fosfato 0,5 M (pH 7,4) e 1 g/l di soluzione di blu nitrotetrazolio. Prima dell'uso, vengono aggiunti alla miscela 0,25 ml di una soluzione di fenanzina metasolfato con una concentrazione di 1 g / l.

Soluzione di substrato per la determinazione della fruttosio bisfosfato aldolasi. 270 mg del sale di bario del fruttosio bisfosfato vengono sciolti in 3,5 ml di acido cloridrico 1 M. Si aggiunge 1 ml di soluzione di solfato di sodio al 14% e si allontana il precipitato formatosi per centrifugazione. Aggiungere 1 goccia di solfato di sodio al supernatante. La comparsa di torbidità indica una deposizione insufficientemente completa di ioni bario. In questo caso si aggiunge più solfato di sodio e si centrifuga nuovamente. Il centrifugato viene regolato con una soluzione di idrossido di sodio al 3% a pH 7,4-7,6, trasferito in un matraccio da 25 ml e il volume viene regolato al segno. La soluzione risultante viene miscelata con 25 ml di una soluzione 0,56 M di idrazina cloruro, 25 ml di una soluzione 0,002 M di acido monoiodoacetico, 100 ml di una soluzione di carbonato di sodio allo 0,5% e 25 ml di acqua distillata. Conservato in frigorifero.

Tampone timolo-veronale. In un matraccio tarato da 100 ml, mescolare 80 ml di una soluzione tampone e 1 ml di una soluzione alcolica al 10% di timolo, agitare e aggiungere la soluzione tampone fino alla tacca. Il valore del pH dovrebbe essere 7,55.

Reagente o-toluidina. 0,15 g di tiourea vengono sciolti in 94 ml di acido acetico glaciale e mescolati con 6 ml di O-toluidina distillata. Conservato in una bottiglia scura.

Fenolo saturo di acqua. 35 ml di acqua vengono aggiunti a 100 g di fenolo distillato e agitati, riscaldando leggermente la miscela per accelerare la dissoluzione del fenolo.

Fenolftalene, soluzione di lavoro. Preparare sciogliendo 75 mg della sostanza in 15 ml di soluzione di idrossido di sodio 0,1 N, la soluzione deve essere incolore o leggermente rosata, le soluzioni colorate non sono adatte al lavoro. Per aumentare la resistenza del reagente, ad esso vengono aggiunti 3 mg di trilon che, legando i sali dei metalli pesanti, impedisce l'autoossidazione della fenolftaleina da parte dell'ossigeno atmosferico.

Fibrina. La fibrina nel sangue bovino viene lavata dai pigmenti del sangue in acqua corrente per diversi giorni fino a ottenere un coagulo bianco. L'acqua viene spremuta e la fibrina, piena di glicerina, viene conservata in un barattolo ben chiuso. Prima dell'uso, la fibrina viene lavata dalla glicerina.

Reagente fosforo-vanillina. 4 parti (in volume) di acido fosforico concentrato vengono miscelate con 1 parte di una soluzione acquosa allo 0,6% di vanillina. Il reagente viene conservato in un contenitore di vetro scuro a temperatura ambiente.

Fruttosio 1,6-bisfosfato, sale sodico. 2,0 ml di una soluzione al 10% di sale sodico di fruttosio-1,6-bisfosfato vengono diluiti in un matraccio da 25 ml con acqua fino alla tacca. Stabile se conservato in frigorifero.

Reagente colorato per urea. La compressa del kit per la determinazione dell'urea contenente diacetil monoossima e tiosemicarbazide viene sciolta riscaldando in un matraccio da 50 ml. La soluzione è stabile per tre settimane. Prima dell'uso, mescolare volumi uguali della soluzione preparata e una soluzione di acido solforico al 9,6%.

Soluzione alcalina di β-glicerofosfato. In un matraccio tarato della capacità di 100 ml aggiungere 1 g di β-glicerofosfato di sodio e 0,85 g di medinal, aggiungere circa 30 ml di acqua distillata, sciogliere e portare a volume con acqua. In un altro matraccio tarato della capacità di 100 ml aggiungere 50 ml della soluzione preparata di β-glicerofosfato, 2,8 ml di soluzione di idrossido di sodio 0,1 M e portare a segno con acqua distillata (soluzione pH 8,6). Adagiare sul liquido circa 3 ml di toluene. Conservare la soluzione in frigorifero per non più di 10 giorni.

Prendendo il sangue, preparando una "striscia sottile" e una "goccia spessa"

movimento dei batteri. La struttura del flagello, spessore, lunghezza, composizione chimica. Preparazione di preparazioni fisse e preparazioni di cellule viventi di microrganismi.

I reagenti chimicamente puri vengono utilizzati per preparare soluzioni tampone. e grado analitico, appositamente preparato. I reagenti vengono preparati come segue.

Fosfato di potassio monosostituito, KH 2 PO 4 , peso molecolare 136,09. 100 g del farmaco vengono sciolti quando vengono riscaldati a ebollizione in 150 ml di acqua. La soluzione viene filtrata calda. Con costante agitazione, il filtrato viene raffreddato a 10 ºС. Quindi aggiungere 150 ml di alcol etilico. I cristalli separati sotto costante agitazione del filtrato vengono filtrati su un imbuto di aspirazione e ricristallizzati nuovamente nelle stesse condizioni; i cristalli vengono essiccati a peso costante a 105...110 ºС. In presenza di un preparato con il contenuto della sostanza principale nell'intervallo 99,9 ... 100,0%, la preparazione preliminare della sostanza non viene eseguita.

Sodio fosfato disostituito, Na 2 HPO 4 12H 2 O, peso molecolare 358,12. Ci sono due modi per preparare il farmaco.

a) 150 g del farmaco vengono sciolti in 150 ml di acqua quando vengono riscaldati a 100°C. La soluzione viene filtrata calda e, dopo il raffreddamento, i cristalli precipitati vengono filtrati via. La ricristallizzazione viene ripetuta riscaldando a 100 ºС. La preparazione ricristallizzata viene riscaldata in una tazza di porcellana a bagnomaria mescolando continuamente fino a quando la preparazione è completamente asciutta. Il sale risultante viene essiccato in un essiccatore su cloruro di calcio fuso durante il giorno. Nel preparato ricristallizzato (Na 2 HPO 4 ·2H 2 O) viene verificato il contenuto della sostanza principale. Per fare ciò, circa 0,5000 g del farmaco vengono sciolti in 50 ml di acqua, vengono aggiunti 2 ... 3 ml di una soluzione satura di cloruro di sodio e titolati con una soluzione di acido cloridrico 0,1 N in presenza di un indicatore di rosso metile . Se necessario, apportare modifiche alle dimensioni del campione. 1 ml di acido cloridrico esattamente 0,1 N corrisponde a 0,0178 g di Na 2 HPO 4 2H 2 O.

b) 75 g del farmaco vengono sciolti in 250 ml di acqua riscaldata a 60 ºС. La soluzione viene filtrata calda, il filtrato viene raffreddato agitando costantemente a 10 ºС. I cristalli precipitati vengono filtrati su un imbuto di aspirazione e ricristallizzati nuovamente nelle stesse condizioni. Il sale risultante viene prima essiccato a una temperatura non superiore a 30 ºС per 24 ore, quindi viene continuato ad essiccare in forno a 50 ºС per 3-4 ore e infine a 120±5 ºС a peso costante, impedendo al sale di fusione. Dopo l'essiccazione, il sale ha la composizione Na 2 HPO 4 .

Dopo aver preparato i reagenti, vengono preparate soluzioni madre di fosfato di potassio monosostituito e di fosfato di sodio disostituito.

Una porzione di fosfato di potassio anidro monosostituito KH 2 PO 4 del peso di 9,078 g viene sciolta in acqua e il volume della soluzione viene portato a 1 litro. Per stabilizzare la soluzione aggiungere 3-4 gocce di toluene.

Una porzione di fosfato di sodio disostituito Na 2 HPO 4 12H 2 O, del peso di 11,876 g, viene sciolta in acqua e il volume della soluzione viene portato a 1 litro. Per stabilizzare la soluzione aggiungere 3-4 gocce di toluene.

Dalle soluzioni iniziali preparare soluzioni tampone fosfato con un pH compreso tra 4,94 e 9,18 secondo la tabella A.2.

Tabella A.2 - Soluzione tampone fosfato con pH 4,94 ... 9,18

pH	Na 2 HPO 4 12H 2 O soluzione, ml	KH 2 PO 4 soluzione, ml
4,94	1,0	99,0
5,29	2,5	97,5
5,59	5,0	95,0
5,91	10,0	90,0
6,24	20,0	80,0
6,47	30,0	70,0
6,64	40,0	60,0
6,81	50,0	50,0
6,98	60,0	40,0
7,17	70,0	30,0
7,38	80,0	20,0
7,73	90,0	10,0
8,04	95,0	5,0
8,34	97,5	2,5
8,67	99,0	1,0
9,18	100,0	0,0

Data aggiunta: 06-08-2015 | Visualizzazioni: 4058 |

Il pH delle soluzioni tampone è calcolato secondo l'equazione di Henderson-Hasselbach:

– per un tampone acido, l'equazione ha la forma

– per il buffer principale

Le equazioni mostrano che il pH di una soluzione tampone di una data composizione è determinato dal rapporto tra le concentrazioni di acido e sale o base e sale, e quindi non dipende dalla diluizione. Quando il volume della soluzione cambia, la concentrazione di ciascun componente cambia dello stesso numero di volte.

Capacità tampone

La capacità delle soluzioni tampone di mantenere un pH costante è limitata. Quelli. l'aggiunta di acido o alcali senza modificare in modo significativo il pH della soluzione tampone è possibile solo in quantità limitate.

Il valore che caratterizza la capacità di una soluzione tampone di contrastare lo spostamento nella reazione del mezzo quando vengono aggiunti acidi e alcali è chiamato capacità tampone della soluzione (B).

La capacità del tampone è misurata dal numero di moli equivalenti di un acido o base forte, la cui aggiunta a 1 litro di una soluzione tampone cambia il pH di uno.

Matematicamente, la capacità del buffer è definita come segue:

B per acido (mol/lo mmol/l):

,

dove n(1/z HA) è il numero di moli equivalenti dell'acido, pH 0 e pH sono il pH della soluzione tampone prima e dopo l'aggiunta dell'acido, V B è il volume della soluzione tampone.

In alcali (mol/l o mmol/l):

,

dove n (1/z VOH) è il numero di moli equivalenti di alcali, il resto delle designazioni è lo stesso.

La capacità del buffer dipende da una serie di fattori:

1. Dalla natura delle sostanze e dei componenti aggiunti della soluzione tampone. Perché alcune sostanze possono formare composti o complessi insolubili o dare altre reazioni indesiderate con i componenti del sistema tampone, quindi il concetto di capacità tampone perde di significato.

2. Dalla concentrazione iniziale dei componenti del sistema tampone.

Maggiore è il numero di componenti della coppia acido-base nella soluzione, maggiore è la capacità tampone di questa soluzione.

Il limite del rapporto tra le concentrazioni dei componenti della soluzione tampone, al quale il sistema conserva ancora le sue proprietà. L'intervallo di pH = pK ± 1 è chiamato zona di azione tampone del sistema. Ciò corrisponde all'intervallo del rapporto Con sale /C a te da 1/10 a 10/1.

B a (sangue) \u003d 0,05 mol / l; da B a (plasma) \u003d 0,03 mol / l; B a (sangue sierico) = 0,025 mol / l

Sistemi tampone ematico

I sistemi tampone sono particolarmente importanti nel mantenimento dell'equilibrio acido-base degli organismi. Il valore del pH della maggior parte dei fluidi intracellulari è compreso tra 6,8 e 7,8.

L'equilibrio acido-basico nel sangue umano è fornito da sistemi tampone di idrocarbonato, fosfato, proteine ​​ed emoglobina. Il valore normale del pH del plasma sanguigno è 7,40 ± 0,05.

Il sistema tampone dell'emoglobina fornisce il 35% di capacità tampone del sangue: . L'ossiemoglobina è un acido più forte dell'emoglobina ridotta. L'ossiemoglobina è solitamente sotto forma di sale di potassio.

Sistema tampone carbonato : è al primo posto in termini di potenza. È rappresentato da acido carbonico (H 2 CO 3) e bicarbonato di sodio o potassio (NaHCO 3, KHCO 3) in un rapporto di 1/20. Il tampone bicarbonato è ampiamente utilizzato per correggere i disturbi acido-base nel corpo.

Sistema tampone fosfato . Il diidrofosfato ha le proprietà di un acido debole e interagisce con i prodotti alcalini che entrano nel flusso sanguigno. L'idrofosfato ha le proprietà di un alcali debole e reagisce con acidi più forti.

Il sistema tampone proteico svolge il ruolo di neutralizzare acidi e alcali per le sue proprietà anfotere: in un ambiente acido le proteine ​​plasmatiche si comportano come basi, in uno basico come acidi:

Nei tessuti sono presenti anche sistemi tampone, che contribuiscono a mantenere il pH dei tessuti a un livello relativamente costante. I principali tamponi tissutali sono proteine ​​e fosfati. Il mantenimento del pH viene effettuato anche con l'aiuto dei polmoni e dei reni. L'anidride carbonica in eccesso viene rimossa attraverso i polmoni. I reni con acidosi secernono più fosfato di sodio monobasico acido e con alcalosi - più sali alcalini: fosfato di sodio bibasico e bicarbonato di sodio.

Esempi di problem solving

Soluzione:

Calcoliamo il pH della soluzione tampone acida usando la formula , quindi

Risposta: 5,76

Soluzione:

Calcoliamo la capacità del buffer utilizzando la formula:

Risposta: 0,021 mol/l

Esempio 3

La soluzione tampone è costituita da 100 ml di acido acetico 0,1 mol/l e 200 ml di acetato di sodio 0,2 mol/l. Come cambierà il pH di questa soluzione se si aggiungono 30 ml di soluzione di idrossido di sodio 0,2 mol/l.

Soluzione:

Calcoliamo il pH della soluzione tampone utilizzando la formula:

Quando si aggiunge NaOH alla soluzione tampone, la quantità di sale aumenta e la quantità di acido nella soluzione tampone diminuisce:

0,006 0,006 0,006

CH 3 COOH + NaOH \u003d CH 3 COONa + H 2 O

Calcoliamo n (NaOH) \u003d 0,03 l 0,2 mol / l \u003d 0,006 mol, quindi, nella soluzione tampone, la quantità di acido diminuisce di 0,006 mol e la quantità di sale aumenta di 0,006 mol.

Calcoliamo il pH della soluzione usando la formula:

Quindi: pH 2 - pH 1 = 5,82 - 5,3 = 0,52

Risposta: variazione del pH del tampone = 0,52.

Compiti per soluzione indipendente

4. Per titolare 2 ml di sangue per modificare il pH dal valore iniziale (7.36) al valore finale (7.0), è stato necessario aggiungere 1.6 ml di una soluzione di HCl 0.01 M. Calcolare la capacità del tampone acido.

5. Quante moli di acetato di sodio devono essere aggiunte a 300 ml di acido acetico per ridurre di 300 volte la concentrazione di ioni idrogeno (K dis (CH 3 coon) = 1.85.10 -5).

6. Negli studi biochimici viene utilizzato un tampone fosfato con pH = 7,4. In quale rapporto devono essere miscelate soluzioni di sodio idrogeno fosfato e sodio diidrogeno fosfato con una concentrazione di 0,1 mol / l ciascuna per ottenere una tale soluzione tampone (pK (H 2 PO 4 -) \u003d 7,4).

7. Quali violazioni della CBS si osservano con i seguenti indicatori: pH del sangue = 7,20, Pco 2 = 38 mm Hg. Art., BO = 30 mmol/l, SBO = -4 mmol/l. Come eliminare questa violazione di KOS?

Compiti di prova

Tween-20 Phosphate Wash Buffer for Immunohistochemistry è un concentrato (20x) che, dopo la diluizione, viene utilizzato per lavare i vetrini dei reagenti e per la conservazione a breve termine dei campioni di immunoistochimica tra le procedure. Dopo la diluizione, una soluzione 0,01 M pronta all'uso ha un pH di 7,4±0,1. L'uso di questa soluzione salina tamponata con fosfato consente non solo di fornire un lavaggio di alta qualità, ma anche di preservare le caratteristiche morfologiche degli anticorpi utilizzati e dei loro epitopi, il che facilita il legame specifico richiesto per la reazione immunoistochimica. L'aggiunta di Tween-20 al PBS favorisce un lavaggio più efficiente e previene la colorazione non specifica.

I nostri vantaggi:

Al momento stiamo collaborando con i principali produttori esteri di reagenti da laboratorio. I nostri clienti sono istituzioni sia statali che non statali, comprese organizzazioni mediche a Mosca e in altre città della Russia. Per i clienti abituali esiste un sistema di sconti.