Wymagania dotyczące pobierania i przygotowania materiału biologicznego do badań hematologicznych.

Wymagania dotyczące transportu i przechowywania materiału biologicznego do badań hematologicznych.

Prawidłowe wypełnienie kierunku do badania układu hemostazy:

Imię i nazwisko, wiek, płeć pacjenta

Czas pobrania krwi do badań

Diagnoza kliniczna (krótko)

Hematokryt

Zespół krwotoczny (krwawienie z nosa, macicy itp.), zakrzepica (wskazuje lokalizację), wstrząs, niewydolność wielonarządowa, uraz, zespół przedłużonego ucisku, oparzenia itp.)

Wskaż przyjmowane leki, które wpływają na parametry hemostazy, wskazując dawkowanie, metodę i datę ostatniego podania

Przedział czasowy na pobieranie próbek (krwi), ograniczenia dietetyczne i ruchowe są przestrzegane:

Planowe pobieranie krwi odbywa się od 7 do 9 rano, z pacjentem leżącym lub siedzącym. Podczas badania hemostazy w dynamice pożądane jest pobieranie krwi w tej samej pozycji ciała, co poprzednia.

Krew pobierana jest na pusty żołądek, 12-14 godzin po ostatnim posiłku.

Przed pobraniem krwi pożądane jest, aby pacjent odpoczywał przez 15 minut.

Wyjątki: badania hemostazy metodą cito, ocena APTT.

W przeddzień planowanego badania (w ciągu 24 godzin) pacjent powstrzymuje się od znacznego wysiłku fizycznego, spożycia alkoholu. Pożądane jest, aby pacjent nie spożywał tłustych pokarmów w przeddzień pobrania krwi.

Interwencja chirurgiczna prowadzi do zmiany hemostazy na okres od kilku dni do kilku tygodni.

Czynniki wpływające na hemostazę to iniekcje, infuzje, transfuzje, nakłucia, biopsje, masaże, dializy, wprowadzenie środków nieprzepuszczających promieniowania, immunoscyntyografia, promieniowanie jonizujące, badanie endoskopowe, specjalne diety.

ZASADY POBIERANIA KRWI

Krew pobierana jest z żyły obwodowej (najczęściej łokciowej).

Pobieranie krwi odbywa się wyłącznie przy użyciu systemu próżniowego do pobierania próbek w probówkach ze specjalnym oznaczeniem kolorem w zależności od użytego antykoagulantu ( cytrynian sodu 3,2%) w stosunku: 1 objętość cytrynianu sodu na 9 objętości krwi.

Na badania poziom płytek krwi pobranie krwi w probówce z EDTA(kodowanie kolorem liliowym). Badanie poziomu płytek krwi jest przepisywane w przypadku braku klinicznego badania krwi lub gdy patologiczne wartości poziomu płytek krwi są uzyskiwane w klinicznym badaniu krwi

Dozwolona jest krótka opaska uciskowa, nie dłużej niż 60 sekund. Zdejmij opaskę uciskową natychmiast po wprowadzeniu igły do ​​żyły. W przypadku pobierania krwi do badania układu krzepnięcia ważne jest, aby nie można było masować żył, pukać w nie.

Użyj igły do ​​pobierania krwi o średnicy wewnętrznej 0,7-1 mm (rozmiar 19-22).

Stosowanie strzykawki jest niedopuszczalne ze względu na aktywację płytek krwi i czynników krzepnięcia krwi przez turbulentny ruch krwi i jej mieszanie z powietrzem (pienienie). Jest wykluczony w przypadku używania pojemników próżniowych.

Po wkłuciu igły do ​​żyły załóż pojemnik próżniowy, krew zacznie płynąć do pojemnika grawitacyjnie.

Pobierz krew do badania koagulologicznego druga probówka, pierwsze użycie do innych badań, na przykład biochemicznych. Jeśli probówka koagulacyjna ma zostać pobrana jako pierwsza, wciągnij pierwsze 5 ml krwi do pustej probówki i wyrzuć do zapobiec przedostawaniu się tromboplastyny ​​tkankowej do próbki.

Natychmiast po pobraniu delikatnie wymieszać krew bez spieniania z antykoagulantem (odwrócić probówkę 3-4 razy).

Po pobraniu materiału biologicznego sprawdź próbkę krwi. Dokładne sprawdzanie próbek krwi pozwala uniknąć następujących błędów: nieprawidłowy stosunek objętości krwi do cytrynianu; częściowo zakrzepła krew.

Krew dostarczana jest do laboratorium w ciągu 45 minut po jej pobraniu. Podczas transportu krwi nie wolno wstrząsać. Próbki krwi nie powinny być transportowane w temperaturach poniżej 4°C i powyżej 30°C.

Asystent paramedyczno-laboratoryjny (technolog medyczny) wykonuje:

kontrola wejściowa dostarczonej krwi, w tym: 1) sprawdzenie poprawności wypełnienia formularza skierowania. 2) sprawdzenie adekwatności dostarczonej objętości krwi zgodnie z etykietą na probówce, 3) sprawdzenie próbki pod kątem braku skrzepów, gdy probówka jest powoli przechylana.

odwirowanie dostarczonej krwi w celu uzyskania:

Plazmę bogatą w osocza ( parametry wirowania: rpm = 1000 rpm (ok. 150-200g), czas wirowania 5-7 minut.

Aby wybrać optymalne warunki wirowania, kierują się siłą odśrodkową (g). Możesz użyć formuły:

g = 1,118 x 0,00001r x n2,

gdzie r to promień wirówki - odległość w centymetrach między osią wirnika a środkiem probówki w gnieździe wirówki; n to liczba obrotów na minutę.

osocze ubogopłytkowe parametry wirowania: rpm = ~2500-3000 rpm (około 1500-2000g), czas wirowania 10-20 minut. W celu całkowitego usunięcia płytek krwi wykonuje się powtórne wirowanie, parametry wirowania pozostają takie same.

3. Po odwirowaniu sprawdza osocze pod kątem barwy i przezroczystości: próbka zhemolizowana, osocze żółtaczkowe lub lipemiczne (chylowe) nie podlegają badaniu.

Po odwirowaniu supernatant jest usuwany.

Pożądany badanie parametrów hemostazy podczas 2 godziny po pobraniu krwi, ale dozwolony badanie parametrów koagulologicznych w w ciągu 4 godzin jeśli osocze zostało oddzielone od osadu erytrocytów i leukocytów.

Jeśli to konieczne przechowywanie długoterminowe„świeże” próbki (nie później niż 2 godziny po pobraniu krwi) osocze bezpłytkowe może być raz zamrażać i przechowywać do 2 tygodni w -20°C lub do 6 miesięcy w -70°C. Osocze należy szybko rozmrozić w ciepłej wodzie (+36°C), dokładnie wymieszać i natychmiast zbadać. Po zamrożeniu możliwa jest zmiana APTT.

Sposób przygotowania mikropreparatów do badań hematologicznych, metody utrwalania i barwienia.

Sposób przygotowania rozmazów krwi do badań hematologicznych.

Przygotowanie i obróbka szkieł. Nowe czyste szkła można stosować po odtłuszczeniu w mieszaninie Nikiforov (równe części 96% alkoholu etylowego i eteru). Zużyte szklanki moczy się na dzień w ciepłym roztworze mydła lub roztworze proszku do prania (1 łyżka proszku na 5 litrów wody). Dzień później roztwór jest spuszczany, szkło myje się pod bieżącą wodą. Następnie ponownie wlewa się je ciepłym roztworem mydła lub roztworem proszku do prania i doprowadza do wrzenia, gotuje w tym samym roztworze przez 5-10 minut (nie więcej, aby uniknąć zmętnienia okularów). Po schłodzeniu roztworu ponownie go odsącza się, szkiełka płucze się pod bieżącą wodą, a każde szkiełko myje się szczoteczką pod bieżącą wodą. Tak potraktowane szklanki układa się do wyschnięcia na czystym prześcieradle. Czyste szklanki do odtłuszczania umieszcza się w mieszaninie Nikiforova lub 96% alkoholu etylowego na 60 minut, a następnie wyciera do sucha i przechowuje w czystym pojemniku z szeroką szyjką. Czyste okulary zaleca się nosić pęsetą lub rękoma za boczne krawędzie.

Przygotowanie rozmazów. Niewielką kroplę krwi nanosi się na suchy, przygotowany szkiełko bliżej krótszego boku za pomocą szklanego pręcika (lub bezpośrednio z miejsca nakłucia palca). Pozostaw szkło w pozycji poziomej i rozsmaruj krew na szkle suchym, czystym, szlifowanym szkłem, trzymając pod kątem 45°. Krótką krawędzią, po odczekaniu, aż cała krew się po niej rozleje, szybko przeciąga się je na szkiełku podstawowym. Nie należy wywierać silnego nacisku na szkiełko, ponieważ może to uszkodzić komórki krwi. Rozmazy suszy się na powietrzu i zaznacza (najlepiej zwykłym ołówkiem). Wysuszony rozmaz powinien być równomiernie cienki, żółtawy, odpowiedniej wielkości, umieszczony w odległości 1,0-1,5 cm od krawędzi szkła, zajmować prawie całą długość szkła i kończyć się „wiechą”. Nie należy stosować rozmazów gęstych (ciemnoróżowych), ponieważ morfologia komórek jest w nich trudna do rozpoznania.

Rozmazy o standardowej jakości uzyskuje się za pomocą automatycznych urządzeń przeznaczonych do przygotowania rozmazów i produkowanych przez różne firmy.

Utrwalanie i barwienie rozmazów krwi. Przed barwieniem rozmazy krwi są zwykle utrwalane przez 5–10 minut w alkoholu metylowym, aby zapobiec hemolizie, która może wystąpić w wyniku kontaktu z wodą podczas barwienia barwnikiem rozpuszczalnym w wodzie lub w późniejszym kontakcie z wodą. Techniki utrwalania są opisane poniżej wraz z technikami barwienia. Utrwalanie nie jest wymagane w przypadku plam Wright i Leishman, ponieważ te plamy zawierają alkohol metylowy.

Suche waciki można przechowywać przez 2 dni w suchym, ciepłym miejscu, w gorącej, wilgotnej atmosferze bez utrwalania, przechowuje się je znacznie krócej.

Komórki krwi zawierają struktury bazofilowe i acidofilne, które różnią się odczynem (pH). Jądra bazofilowe i barwią się na niebiesko. Wysoce zasadofilowe (kwaśne) granulki bazofilowe są również niebieskie. Hemoglobina (będąc zasadą) barwi się kwasolubnie, czyli na czerwono. Barwienie kombinacją barwników kwasowych i zasadowych nazywa się barwieniem Romanowskiego i ma różne modyfikacje (Pappenheim, Wright, Noht, Leishman, Giemsa, Jayner itp.). Błękit metylenowy jest zwykle używany jako główny barwnik, ale stosuje się również błękit toluidynowy. Jako barwnik kwasowy stosuje się eozynę, lazur I i lazur II.

Kryteria dobrego barwienia: różowy kolor erytrocytów, fioletowe zabarwienie ziarnistości neutrofili na różowym tle, delikatne azurofilowe ziarnistość monocytów.

Aby rozcieńczyć farbę, najlepiej użyć neutralnej świeżej wody destylowanej. Zwietrzała woda destylowana staje się kwaśna z powodu wychwytywania dwutlenku węgla z atmosfery. Jeśli woda destylowana ma odczyn zasadowy, czerwone krwinki przybierają brudny, niebiesko-zielony kolor; ta część leukocytów, która powinna być zabarwiona na niebiesko, staje się fioletowa, granulki eozynofili stają się niebieskawe i zielonkawe zamiast różowych, a granulki neutrofili są utrwalone. W kwaśnej wodzie erytrocyty stają się jasnopomarańczowe, a jądra leukocytów są bardzo blade. Idealna jest woda destylowana o pH 7,0, która jest buforowana w celu jej zachowania. Możesz użyć gotowych do użycia tabletek buforowych rozpuszczonych w wodzie destylowanej.

Do barwienia rozmazów szpiku kostnego idealny jest barwnik o pH 7,4-7,5.

Metody barwienia według Nohta i Pappenheima są akceptowane jako ujednolicone.

Odczynniki do utrwalania: 1) alkohol metylowy lub 2) roztwór eozyny May-Grunwald z błękitem metylenowym.

Odczynniki do barwienia rozmazów według Nokhta: 1) podstawowy roztwór lazuru I: 1 g farby rozpuszcza się w 1 litrze wody destylowanej, pozostawia w naczyniu z ciemnego szkła na 12-14 dni w temperaturze pokojowej, po czym jest używany; 2) zasadowy roztwór eozyny potasowej: 1 g farby rozpuszcza się w 1 litrze wody destylowanej, pozostawia w pojemniku z ciemnego szkła na 12-14 dni w temperaturze pokojowej, po czym używa; 3) bufor fosforanowy (mieszanina Weise), pH 7,4-7,5: zmieszać 0,49 g diwodorofosforanu potasu (KH2PO4) i 0,909 g wodorofosforanu sodu (Na2HPO4) i rozpuścić w 1 litrze wody destylowanej; 4) roztwór roboczy azure-eozyny: przed użyciem zmieszać 25 ml roztworu podstawowego azure II, 20 ml roztworu podstawowego eozyny potasowej i 55 ml roztworu buforowego (proporcje barwników mogą się różnić, są ustalone empirycznie podczas przygotowywania świeżych partii roztworów podstawowych).

Odczynniki do barwienia rozmazów wg Pappenheima: 1) roztwór eozyna-błękit metylenowy wg May-Grunwalda. W przypadku braku gotowego roztworu barwnika przygotowuje się go przez rozpuszczenie 1 g suchej farby w 1 litrze alkoholu metylowego; 2) roztwór roboczy azure-eozyny według Nokhta.

Utrwalanie rozmazów. Roztwór utrwalający wlewa się do kuwety lub do naczynia z szerokim otworem ze zmielonym korkiem. Rozmazy umieszcza się w pojemniku, który zanurza się w kuwecie lub umieszcza jeden po drugim w naczyniu na 5-10 minut. Pojemnik ze szklankami wyjmuje się z roztworu utrwalającego (lub szklanki wyjmuje się pęsetą i umieszcza w stojaku) i pozostawia na powietrzu do całkowitego wyschnięcia.

Barwienie wg Nochta. Wysuszone, utrwalone rozmazy, bez wyjmowania z pojemnika, umieszcza się w kuwecie z roboczym roztworem farby na ściśle określony czas (20-45 minut), który dobierany jest empirycznie dla każdej partii farby. W przypadku braku kuwety z pojemnikiem szkło umieszcza się poziomo na dwóch szklanych prętach („szynach”) ustawionych równolegle z ruchem do góry i wylewa na nie 3-4 ml roboczego roztworu farby. Pojemnik ze szklankami wyjmuje się z kuwety z barwnikiem i umieszcza w kuwecie z wodą z kranu (w przypadku braku pojemników farbę zmywa się ze szklanek wodą bez wyjmowania ich ze szklanych pręcików). Rozmazy są suszone na powietrzu.

Farbowanie Pappenheima. Suche nieutrwalone rozmazy umieszcza się w pojemniku i zanurza w kuwecie z roztworem May-Grunwalda na 3-5 minut (lub 3-4 ml barwnika wlewa się pipetą na nieutrwalony rozmaz). Pojemnik z rozmazami płucze się w kuwecie wodą destylowaną, a następnie umieszcza się w kuwecie z farbą lazurowo-eozyną według Nokhta na 8-15 minut. Do szkiełek umieszczonych na „szynach” dodaje się wodę destylowaną bez spuszczania barwnika przez 1 minutę, a następnie farbę wylewa się na rozmaz na 8–15 minut, po czym farbę zmywa się wodą. Rozmazy są suszone na powietrzu.

Kolorystyka według Romanowskiego-Giemsy. Wyprodukowane w taki sam sposób jak wg Nokhta. Jako barwnik stosuje się gotowy roztwór Romanowskiego-Giemsy, który przed użyciem rozcieńcza się w ilości 1 kropli barwnika na 1 ml wody destylowanej. Czas barwienia jest ustalany empirycznie dla każdej partii barwnika (25-40 min).

Wright kolorystyka. Odczynniki. 0,2 g barwnika Wrighta (suchy proszek, BDH/E. Merck) rozpuszcza się w 100 ml metanolu i odstawia na kilka dni. Jeśli erytrocyty nie są wystarczająco wyraźnie zabarwione, przygotować roztwór 0,25% lub 0,3%.

Postęp kolorowania. Kilka (około 8) kropli farby nanosi się na rozmaz, odstawia na 2-3 minuty (upewnić się, że farba nie wysycha), a następnie na rozmaz wlewa się równą ilość zbuforowanej wody. Jeśli farba dojrzeje, na powierzchni rozcieńczonej farby pojawi się pianka lub film o metalicznym połysku. Rozcieńczoną farbę pozostawia się na rozmazie na 2-3 minuty, a następnie zmywa roztworem buforowym lub wodą. Farba nie może osiadać na powierzchni rozmazu. Jeśli tak się stanie, rozmaz jest wypełniany nierozcieńczoną farbą przez 15-20 sekund, a następnie ponownie roztworem buforowym lub wodą.

Przygotowanie buforu fosforanowego.

Roztwór A (0,2 M KH2PO4): Rozpuść 27,2 g soli w 1 litrze wody destylowanej.

Roztwór B (0,2 M Na2HPO4): Rozpuścić 35,6 g Na2HPO4 × 2H20 w 1 litrze wody destylowanej.

Aby uzyskać 100 ml roztworu buforowego o pożądanym pH, roztwory A i B należy osuszyć w ilościach wskazanych w tabeli. Wartość pH sprawdza się pehametrem.

Przygotowanie roztworu buforu fosforanowego

Roztwór, ml	wartość PH

Kolorowanki Leiszmana. Odczynniki. 0,15 g suchej farby Leishman's rozpuszcza się w 133 ml absolutnego alkoholu metylowego. Farba powinna całkowicie się rozpuścić, wskazane jest wcześniejsze zmielenie kryształków farby w moździerzu. Przechowuj farbę w butelce ze szklanym korkiem, nie filtruj.

Postęp kolorowania. Przeprowadzono podobnie jak barwienie Wrighta, ale z podwójnym rozcieńczeniem roztworu buforowego. Kilka kropel farby (około 8) wylewa się na rozmaz, trzyma przez 2 minuty. Dodaj podwójną ilość roztworu buforowego (16 kropli), wymieszaj kołysząc i pozostaw na 7-10 minut. Farbę zmywa się wodą destylowaną w ciągu 2-3 sekund. Przy dłuższym praniu kolor się pogarsza. Rozmazy są suszone na stojaku na powietrzu.

Przygotowanie gęstej kropli krwi. Trzy krople krwi naniesione na szkiełko w pewnej odległości od siebie rozpręża się pod kątem czystego szkiełka do wielkości około 1 cm średnicy, zaznacza ołówkiem, a następnie suszy na powietrzu przez 1–2 godziny.

Barwienie grubą kroplą krwi. Grube krople krwi nie są naprawione. Szklane szkiełka z dobrze wysuszonymi grubymi kroplami umieszcza się na „szynach” w pewnej odległości od siebie i wylewa się na nie roztwór roboczy azure-eozyny według Nokhta przez 8-10 minut. Dochodzi do „wypłukiwania” erytrocytów. Następnie farbę spuszcza się i na preparaty wlewa się nową porcję roztworu roboczego azure-eozyny według Nokhta przez 30-35 minut. Szkiełka są następnie ostrożnie płukane wodą destylowaną i suszone.

Automatyczne barwienie rozmazów

Ponieważ jedną z najbardziej pożądanych funkcji w laboratorium hematologicznym jest przygotowanie i barwienie rozmazów krwi, próby ich zautomatyzowania są naturalne.

Pierwszy automatyczny system przygotowania rozmazów został opracowany przez firmę Sysmex (Japonia) w 1990 roku, a obecnie na całym świecie zainstalowanych jest ponad 1600 systemów. Ogromne doświadczenie zgromadzone w tym okresie zostało wykorzystane przy opracowaniu systemu nowej generacji – w pełni zautomatyzowanej stacji przygotowania i barwienia rozmazów SP-1000i o wydajności do 120 rozmazów na godzinę. SP-1000i realizuje wysoki stopień standaryzacji i jakości w przygotowaniu rozmazów za pomocą inteligentnej metody klinowej, która pozwala użytkownikowi dostosować ilość naniesionej próbki krwi, kąt nachylenia ostrza mazającego, szybkość aplikacji i czas oczekiwania, w zależności od na hematokrycie badanej próbki, stosując od 8 do 16 różnych poziomów regulacji. Pobieranie krwi można pobierać ręcznie lub automatycznie z otwartych lub zamkniętych probówek. Automatyczna stacja przygotowania i barwienia rozmazów Sysmex SP-1000i (Japonia)

System wykorzystuje do siedmiu elastycznie konfigurowalnych protokołów barwienia, które umożliwiają standaryzację jakości barwienia rozmazu i spełnienie najwyższych wymagań. Można stosować następujące protokoły barwienia podwójnego i pojedynczego: wg May-Grunwald-Giemsa, wg Romanovsky'ego i wg Romanovsky-Giemsa. Rozmazy krwi są barwione w dedykowanym systemie kasetowym, który zawiera tylko jeden preparat na kasetę. Dzięki tej metodzie gwarantowana jest dobra relacja między rozmazem krwi a odczynnikami barwiącymi i nie dochodzi do parowania metanolu z odczynnika do powietrza. Aby zapewnić dobre utrwalenie krwi przed barwieniem, do procesu barwienia włączono oddzielny etap wstępnego utrwalania metanolu.

Ze względu na elastyczność protokołu barwienia można zastosować specjalny protokół barwienia szpiku kostnego.

Sposób przygotowania rozmazów szpiku kostnego do badań hematologicznych.

Badanie szpiku kostnego - mielogram Pierwszym pytaniem, na które musi odpowiedzieć badanie szpiku kostnego, jest ilościowy aspekt komórek. Powszechnie wiadomo, że w odniesieniu do krwi obwodowej można określić szereg wartości liczbowych liczby i procentu różnych typów komórek, ponieważ są one w stanie wolnym i są stosunkowo równomiernie rozłożone w zawiesinie krwi naczyniowej . Zupełnie inaczej można powiedzieć o szpiku kostnym: skład tkanki krwiotwórczej jest bardzo niejednorodny, a rozmieszczenie komórek szpiku kostnego nie jest takie samo. Tak więc bezpośrednia liczba mielokaryocytów w komorze waha się w bardzo szerokim zakresie, zarówno w stanie normalnym, jak iw ramach tej samej choroby. Wartości, które znaleźliśmy u osobników zwykle wahały się od 27 000 do 112 000 pierwiastków jądrowych na mm3 (Ursya). Dane literaturowe podlegają jeszcze większym wahaniom, z limitami 12 000 i 300 000 na mm3 (Cartwright, Page). Po odwirowaniu w probówce z hematokrytem znajdują się następujące 4 warstwy: 1) górna żółta warstwa tłuszczowa; 2) plazma; 3) szaro-białawą warstwę utworzoną z komórek jądrowych; 4) czerwona warstwa złożona z erytrocytów. Pomiar szarobiałej warstwy komórek jądrzastych (mielokrytu) ma ograniczoną wartość, a nawet wprowadza w błąd, ponieważ wartości znalezione u zdrowych osobników również wykazują znaczne wahania. Ponadto komórki jądrowe znajdują się nie tylko w tej warstwie, ale także w warstwach tłuszczu i erytrocytów. Ale rozmazy koncentratu szpiku kostnego można przygotować z szarobiałej warstwy po usunięciu supernatantu osocza. Okazały się przydatne w procesie diagnostycznym w przypadkach, gdy rozmazy bezpośrednie są ubogie w komórki. Biorąc pod uwagę, że zliczenia komór mielokaryocytów i oznaczenia mielokrytu dostarczają jedynie przybliżonych wyników o ograniczonej odtwarzalności, te metody oznaczania ilościowego nie są zadowalające. Materiał pobrany podczas nakłucia ssącego to próbka szpiku kostnego zmieszana z krwią w różnych proporcjach. Stopień rozcieńczenia szpiku kostnego krwią zależy od wielu czynników. Oznaczenie 32P dowiodło, że rozcieńczenie aspirowanego szpiku kostnego krwią wynosi od 40% do 100%. Należy jednak zauważyć, że badanie szpiku kostnego w celu postawienia diagnozy opiera się przede wszystkim na jakościowym badaniu zawartości komórkowej, a dopiero wtórnie na wartościach ilościowych tej zawartości. Dlatego ilościowe metody oznaczania komórek szpiku kostnego polegają na półilościowej ocenie składu komórkowego szpiku kostnego w porównaniu z próbkami prawidłowymi na: a) rozmazach ze zmiażdżonymi grudkami; b) przekroje histologiczne. Badanie rozmazu prowadzi się głównie za pomocą suchej soczewki, na kilku rozmazach, w następujących celach: a) półilościowa ocena masy komórek szpiku kostnego; b) oznaczenie obecności i gęstości megakariocytów; c) wykrywanie komórek olbrzymich lub gniazd komórek nieprawidłowych; d) identyfikacja najbardziej odpowiednich obszarów do badań przez zanurzenie. W rozmazach uzyskanych przez kruszenie cząstek szpiku kostnego wyróżnia się następujące trzy koncentryczne strefy: a) centralną; b) zewnętrzne; c) pośrednie. Strefę centralną tworzą wakuole tłuszczu, komórki zrębowe, granulocyty i liczne zniszczone komórki. Strefa zewnętrzna zawiera dużą ilość krwi, która rozrzedza komórki szpiku kostnego. Podobnie jak cienkie rozmazy, przyczynia się jedynie do badania szczegółów morfologicznych komórek szpiku i erytrocytów. Najgęstsza masa komórkowa znajduje się w strefie pośredniej, co pozwala na optymalne badanie, które może wyjaśnić wszystkie postawione pytania. Tutaj komórki szpiku są dobrze zachowane i ułożone w wysepki lub gniazda, tak jak widać to w szpiku. Przy zachowaniu topografii szpiku wyniki badań tej strefy są bardziej jednorodne i odpowiadają rzeczywistemu stanowi szpiku, co potwierdza porównanie z jego obrazami histologicznymi. Półilościowe określenie gęstości komórek wyraża się jako: a) prawidłowy, b) bogaty lub c) chudy w porównaniu z prawidłowym szpikem kostnym. Identyfikacja prawidłowej lub obfitej masy komórkowej jest cennym odkryciem, natomiast skąpy szpik kostny należy traktować z ostrożnością. Aby wykazać obecność rzeczywistej hipoplazji, należy zbadać kilka płytek, wykonać nakłucie w kilku obszarach kości i/lub wykonać biopsję kości. Najdokładniejsze informacje o masie komórek szpiku kostnego uzyskuje się badając wycinki histologiczne. U osoby dorosłej stosunek przestrzeni zajmowanej przez miąższ tkanki tłuszczowej i aktywnych komórek wynosi zwykle 1:1 lub 2:1. Niektórzy autorzy uważają, że szpik kostny jest hipokomórkowy, gdy komórki krwiotwórcze zajmują mniej niż jedną czwartą grudek szpiku kostnego. Do postawienia diagnozy niezbędne jest jakościowe badanie szpiku kostnego. Przeprowadza się go przez zanurzenie zarówno na cienkich rozmazach, jak i w szczególności na rozmazach z pokruszonymi grudkami ze strefy pośredniej. Zaleca się wybór najlepszych prawidłowo rozciągniętych i wybarwionych rozmazów z wyraźnie określonymi i dobrze zachowanymi morfologicznie komórkami. Niniejsze badanie przedstawia: a) identyfikację różnych typów komórek szpikowych; b) określenie stopnia dojrzewania każdego rzędu komórek; c) wyjaśnienie związku między granulocytami a erytroblastami (G/E) d) identyfikacja komórek w fazie mitozy; e) opis napotkanych komórek nietypowych. Po zbadaniu kilku rozmazów sporządzany jest albo szczegółowy opisowy „mielogram” (zawierający wnioski wyciągnięte po rozszyfrowaniu rozmazów), albo mielogram w ujęciu procentowym, ustalony przez co najmniej 300-500 elementów. Istnieją dwa sposoby sporządzenia procentowego mielogramu: 1) przypisanie pozostałych rzędów komórek do 100 granulocytów; 2) wyświetlanie procentowe każdego typu komórek z całkowitej liczby komórek szpiku kostnego. Ze statystycznego punktu widzenia ta druga metoda wydaje się bardziej poprawna i najwyraźniej odzwierciedla rzeczywisty obraz składu komórkowego szpiku kostnego. Wzory ustalane przez poszczególnych autorów znacznie się różnią, ponieważ trudno jest określić rzeczywiste wartości średnie w tak niejednorodnej tkance, jaką jest szpik kostny. W tabeli przedstawiono, według Wintrobe, wyniki badań wybranych próbek szpiku kostnego od 12 zdrowych osób. Prawidłowy mielogram

Parametry mielogramu Wartość średnia (%) Zakres wahań (%)

Komórki siatkowate 0,9 0,1-1,6 Niezróżnicowane blasty 0,6 0,1-1,1 Mieloblasty 1,0 0,2-1,7

Promielocyty 2,5 1,0-4,1

Neutrofile w mielocytach 9,6 7,0-12,2 Neutrofile w metamielocytach 11,5 8,0-15,0 Neutrofile kłute 18,2 12,8-23,7 Neutrofile segmentowane 18,6 13,1-24,1 Całkowita liczba neutrofilów 60,8 52,7-68,9 Mielocyty eozynofilowe 0,1 0,0-0,2 Metamielocyty eozynofilowe 0,2 0,1-0,4 Eozynofile 2,8 0,4-5,2

Suma komórek serii eozynofilowej 3,2 0,5-5,8 Mielocyty zasadochłonne 0,1 0-0,3

Bazofile 0,1 0-0,3

Suma komórek serii bazofilowej 0,2 0-0,5 Limfoblasty 0,1 0-0,2

Prolimfocyty 0,1 0-0,2

Limfocyty 8,8 4,3-13,3

Całkowita liczba komórek limfoidalnych 9,0 4,3-13,7 Monoblasty 0,1 0-0,2

Monocyty 1,9 0,7-3,1

Plazmablasty 0,1 0-0,2

Proplazmocyty 0,1 0,1-0,2

Komórki plazmatyczne 0,9 0,1-1,8

Erytroblasty 0,6 0,2-1,1

Noroblasty bazofilne 3,6 1,4-5,8 Noroblasty polichromatofilowe 12,9 8,9-16,9 Noroblasty oksyfilne 3,2 0,8-5,6

Całkowita liczba komórek erytroidalnych 20,5 14,5-26,5 Megakariocyty 0,4 0,2-0,6

Według naszych badań na zdrowych ludziach wyniki są następujące:

liczba granulocytów 56-70%,

serie erytroblastyczne 23-30%, serie limfoplazmatyczne 5-10%, serie monocytomakrofagowe 1-2% i serie megakariocytowe 0,1-0,8% (Ursya). Zmiana proporcji prawidłowych rzędów szpiku lub ich zastąpienie nieprawidłowymi komórkami często sugeruje rodzaj choroby. Komórki siateczkowate pojawiają się rzadziej, a ponadto w małych ilościach. Całkiem przypadkowo w rozmazach (lub odciskach szpiku kostnego) widoczne są osteoblasty i/lub osteoklasty, których nie należy mylić z komórkami nowotworowymi. Ich obecność częściej obserwuje się u dzieci, rzadziej u dorosłych z pierwotnym zwłóknieniem szpiku lub wtórnie, po przerzutach rakowych, z ostrą białaczką, osteoporozą itp. Stosunek G/E uzyskuje się dzieląc granulocyty przez liczbę erytroblastów. U zdrowej osoby dorosłej stosunek ten wynosi średnio 3/1 lub 4/1, z limitami szacowanymi na 2/1 (gdy uwzględniono tylko niedojrzałe granulocyty) i 5/1 (gdy dotyczy wszystkich granulocytów – dojrzałych i niedojrzałych). Stosunek H/E zmienia się wraz z wiekiem: przy urodzeniu jest mały (1,8/1), w 2 tygodniu życia wzrasta do 11/1, następnie stopniowo spada, a u dzieci jednorocznych osiąga wartości osoby dorosłej. Stosunek H/E jest normalny w przypadkach ogólnej hipo- lub hiperplazji szpiku kostnego, a także w proliferacji pojedynczych komórek, które nie są uwzględnione w obliczeniach tego stosunku, na przykład w plazmocytomie. W białaczkach, reakcjach podobnych do leukomy i erytroblastopenii stosunek ten jest wysoki, podczas gdy w niedokrwistościach z przerostem erytroblastów jest niski lub odwrócony (niedokrwistość megaloblastyczna, hemolityczna). Przed wydaniem danych mielogramowych uzyskanych po badaniu rozmazów konieczne jest wyjaśnienie: a) miejsca nakłucia; b) gęstość kości; c) warunki, w jakich miało miejsce odsysanie; d) aspekt makroskopowy wybranego materiału. Badanie szpiku kostnego to złożony proces oparty na integracji licznych i różnorodnych danych. Jego wynik powinien odzwierciedlać ogólne wnioski, oparte bardziej na wnioskowaniu niż na mechanicznej rejestracji poszczególnych liczb, które zresztą ulegają wahaniom. Wnioski z jakiegokolwiek mielogramu powinny wyjaśniać diagnozę lub wskazania do dodatkowych badań wynikających z badania szpiku kostnego. W chorobach krwi nakłucie ssące pomaga wyjaśnić diagnozę za pomocą rozmazów i skrawków z grudkami w 80% przypadków. W innych przypadkach wskazana jest biopsja kości i badanie histologiczne szpiku kostnego. Selekcja biooptyczna i badanie histologiczne wydają się konieczne w przypadku: a) pierwotnej lub wtórnej mielofibrozy; b) aplazja lub hipoplazja szpiku kostnego; c) choroby występujące ze zmianami typu ziarniniakowego (np. , choroba Godgkina, sarkoidoza, gruźlica itp.); d) przerzuty rakowe; e) we wszystkich przypadkach, gdy materiał wybrany przez nakłucie jest niezadowalający lub wygląd szpiku kostnego nie jest przekonujący. Po pobraniu biooptycznym wyciski przygotowywane są do badania cytologicznego, ponieważ wycinki histologiczne dostarczają niewiele informacji o szczegółach strukturalnych komórek krwiotwórczych, które są stłoczone, nierozproszone i nieustandaryzowane. Ponadto utrwalanie powoduje cofanie się komórek, a barwienie histologiczne jest mniej selektywne niż barwienie cytologiczne. Dlatego pełne badanie szpiku kostnego obejmuje zarówno cytologiczne - na rozmazach lub wyciskach, jak i histologiczne - na odcinkach badania. Należy pamiętać, że cytologiczne i histologiczne metody badania szpiku nie są wykluczone, lecz przeciwnie, uzupełniają się: biopsja jest metodą ilościową i architektoniczną, a mielogram jest metodą jakościową i cytologiczną.

Metoda liczenia krwinek w komorze Goriajewa.

Komnata Goriajewa - urządzenie przeznaczone do zliczania liczby komórek w danej objętości cieczy. Zwykle służy do określenia liczby uformowanych pierwiastków w próbce krwi. Komory składają się z grubej szklanej prowadnicy z nałożonymi na nie poprzecznymi szczelinami, tworzącymi trzy poprzecznie ułożone płaskie obszary. Środkowa platforma jest podzielona podłużną szczeliną na dwie, z których każda ma wygrawerowaną siatkę. Po obu stronach środkowej platformy w komorze Goriajewa znajdują się dwie inne o 0,1 mm wyższe (w komorze Fuchsa-Rosenthala o 0,2 mm) wyższe niż środkowa. Płaszczyzny tych miejsc służą do rozdrabniania szkiełka nakrywkowego, aż do pojawienia się tak zwanych pierścieni Newtona. Po przetarciu szkiełka nakrywkowego powstaje komora zamknięta z dwóch stron, a z dwóch pozostałych szczelin (przestrzenie kapilarne), przez które komora jest napełniana. Zasada siatki jest taka sama. Są podzielone na jedną lub inną liczbę kwadratów, pogrupowanych na różne sposoby. Stałą wartością we wszystkich siatkach jest tzw. „mały kwadrat”, którego bok wynosi 1/20 mm, a więc jego powierzchnia wynosi 1/400 mm2. Za pomocą kamery Goriajewa można również określić powiększenie mikroskopu. Zewnętrznie jest to przezroczysty równoległościan (szklany slajd), z nałożonymi rowkami i mikroskopijną siatką. Wymiary małych podziałek komórki siatkowej wynoszą 0,05 mm, a dużych podziałek 0,2 mm. W tym przypadku siatka jest nakładana na platformę (segment szklany) znajdującą się 0,1 mm niżej niż dwie sąsiednie platformy. Obszary te służą do docierania szkiełka nakrywkowego. W rezultacie objętość cieczy nad kwadratem utworzonym przez duże podziały siatki Goryaeva wynosi 0,004 mikrolitrów. Licząc liczbę komórek na dużym kwadracie, można obliczyć gęstość danego typu komórek w zawiesinie za pomocą wzoru: Liczba komórek/ml = liczba komórek nad dużym kwadratem * 2,5 10^5 Używając aparatu Goryaev jako swego rodzaju standardu, możesz określić powiększenie mikroskopu według wzoru: Kg=(m2-m1)/(a*N) gdzie kg to powiększenie mikroskopu; m 1 - pozycja lewej granicy celi komory Goryaev; m 2 - pozycja prawej granicy komórki lub grupy komórek; N- liczba komórek między zmierzonymi granicami; a- wielkość komórki komory Goriajewa (równa 0,05 mm). Komora Goriajewa służy również do zliczania liczby komórek w hodowli. Formuła liczenia krwinek w komorze Goriajewa to - x = (a 400 c) / b, gdzie x jest pożądaną liczbą kształtek w 1 mm3; a - suma kształtek liczonych w określonej objętości komory; b - liczba zliczonych małych kwadratów; c - rozcieńczenie krwi.

Metoda liczenia oocyst w komorze Goriajewa. Metodę tę stosuje się zwykle przy doświadczalnym zakażaniu zwierząt precyzyjnie określoną ilością oocyst (wstrzykuje się zwierzęciu odpowiednią ilość mililitrów zawiesiny). 1 ml zawiesiny zawierającej oocysty umieszcza się w komorze Goriajewa. Ponieważ objętość komory Goriajewa wynosi 0,9 m3, liczbę zliczonych oocyst mnoży się przez 1111. Otrzymana liczba jest adekwatna do liczby oocyst w 1 cm3 roztworu. Dla dokładniejszego wyznaczenia należy wykonać obliczenia co najmniej trzykrotnie, a następnie wyprowadzić wartość średnią arytmetyczną. Liczbę oocyst wymaganych do zakażenia mierzy się za pomocą pipety miarowej. Aby uzyskać bardziej równomierne rozmieszczenie oocyst w pożywce inkubacyjnej, zawartość probówki należy wielokrotnie wstrząsać.

Liczba erytrocytów w komorze Goriajewa Zasada. Dokładną ilość krwi miesza się równomiernie w określonej ilości płynu i umieszcza w komorze o znanej objętości, w której zawiesina krwi jest rozprowadzana w jednej warstwie. Dno komory jest wykreślone, co umożliwia dokładne zliczenie erytrocytów. Odczynniki: 0,9% roztwór chlorku sodu. Wyposażenie specjalne: mikroskop, aparat Goriajewa, probówki laboratoryjne lub kapilara z hemometru Saly'ego. Postęp definicji. Do suchej, czystej probówki dodać 8 ml 0,9% roztworu chlorku sodu i 0,02 ml krwi. Końcówkę pipety wstępnie wyciera się, krew wdmuchuje się na dno probówki, a pipetę dokładnie myje się górną warstwą płynu. Dobrze wymieszaj zawartość tuby. Uzyskuje się rozcieńczenie krwi 1:400, tj. Krew rozcieńcza się 400 razy. Przy zagęszczeniu krwi wskazane jest jej rozcieńczenie 500, 600, 700, 800 razy. Komorę i szkiełko nakrywkowe należy umyć i wytrzeć do sucha. Szkiełko nakrywkowe pociera się o komorę tak, aby pojawiły się opalizujące pierścienie. Pobrać kroplę rozcieńczonej krwi z probówki i napełnić nią komorę, przykładając ją do brzegu szkiełka nakrywkowego.Erytrocyty zlicza się 1 min po napełnieniu komory pod mikroskopem o małym powiększeniu (obiektyw x8, okular x10 lub x15) za pomocą zakryta przesłona lub obniżony kondensor (w przyciemnionym polu widzenia) . Erytrocyty są liczone w pięciu dużych (lub 80 małych) kwadratach ułożonych po przekątnej. Uwzględniono erytrocyty leżące wewnątrz małego kwadratu, a także na jego lewej i górnej ścianie. Nie liczą się komórki znajdujące się w prawym i dolnym wierszu kwadratu. Obliczenie: Obliczoną liczbę komórek w 80 małych kwadratach mnoży się przez 20 000 przy rozcieńczeniu krwi 1: 400, przez 25 000 przy rozcieńczeniu 1: 500 lub przez 30 000 przy rozcieńczeniu 1: 600 i otrzymuje się wynik końcowy w milionach na 1 μl. W tym przypadku przyjmuje się, że objętość jednego małego kwadratu wynosi 1/4000 μl. Aby policzyć komórki w 1 litrze, liczbę czerwonych krwinek w 1 µl również mnoży się przez 1 000 000. Notatka. Nie wolno badać krwi za pomocą skrzepów; liczenie komórek natychmiast po napełnieniu komory (bez czekania 1 min); stosowanie źle umytych i wysuszonych pipet i probówek, odczynników o niskiej jakości, które powodują hemolizę. Z zastrzeżeniem wszystkich zasad obliczeniowych, błąd wyniesie średnio ± 2,5%.

Zasady dezynfekcji Po użyciu aparat Goryaev musi zostać zdezynfekowany 3% roztwór nadtlenek wodoru, spłucz wodą destylowaną i osusz miękką szmatką. Trzymaj aparat w suchym miejscu.

Metoda pracy z analizatorami hematologicznymi.

Analizator-hematologiczny- urządzenie (zestaw aparatury) przeznaczone do badań ilościowych komórki krew w klinicznych laboratoriach diagnostycznych. Może być automatyczny lub półautomatyczny. Półautomatyczny analizator hematologiczny różni się od automatycznego tym, że proces rozcieńczania próbki krwi przeprowadza oddzielne urządzenie - rozcieńczalnik. Po przygotowaniu rozcieńczenia krwi pełnej, operator musi przenieść rozcieńczoną próbkę do modułu pomiarowego. Obecnie analizatory półautomatyczne praktycznie nie są produkowane.

Automatyczny analizator hematologiczny to w pełni zautomatyzowane urządzenie, w którym cały proces analityczny odbywa się automatycznie.

Nowoczesne automatyczne analizatory są w stanie przetwarzać dziesiątki próbek (od 60 do 120) na godzinę z dokładnością i powtarzalnością do specyfikacji, a także przechowywać wyniki badań we wbudowanej pamięci i w razie potrzeby drukować je na wbudowanej drukarka termiczna lub drukarka zewnętrzna.

Nowoczesne analizatory hematologiczne są klasyfikowane zgodnie z nomenklaturą określonych wskaźników krwinek.

8-parametrowe analizatory hematologiczne określić następujące parametry: stężenie erytrocyty(RBC) leukocyty(WBC) płytki krwi(plc) hemoglobina(Hb), a także następujące parametry erytrocytów: średnia objętość erytrocytów (MCV), średnia zawartość hemoglobiny w erytrocytach (MCH), średnie stężenie hemoglobiny w erytrocytach (MCHC), hematokryt(Hct).

Obecnie praktycznie nie produkuje się ośmioparametrowych analizatorów hematologicznych.

Analizatory hematologiczne klasy 3-diff. Analizatory hematologiczne klasy 3-dif, w zależności od wyprodukowanego modelu, pozwalają określić od 16 do 22 wskaźników krwinek. Analizatory tej klasy oprócz tych parametrów, które określają analizatory ośmioparametrowe, wyznaczają trzy subpopulacje leukocytów: stężenie limfocytów (Lm), granulocytów (Gr) i tzw. średnie leukocyty (Mid) oraz ich procent Lm%, Gr% i Mid%. Stąd nazwa klasy 3-dif. Ponadto analizatory hematologiczne tej klasy określają współczynnik zmienności objętości erytrocytów (RDW) oraz szereg wskaźników charakteryzujących płytki krwi: średnią objętość płytek (MPV), frakcję objętości płytek (Tct) (analogicznie do hematokrytu), współczynnik zmienności objętości płytek krwi (PDW).

Ważną informacją diagnostyczną, którą mogą uzyskać analizatory hematologiczne tej klasy, są funkcje dystrybucji objętości erytrocytów, leukocytów i płytek krwi - histogramy.

Analizatory hematologiczne klasy 5-rozn. Główną różnicą między analizatorami hematologicznymi 5-dif a analizatorami 3-dif jest ich zdolność do wykrywania wszystkich 5 subpopulacji leukocytów: limfocytów (Lym), monocytów (Mon), neutrofili (Neu), bazofilów (Bas) i eozynofili (Eos), jak również ich procentową zawartość Lym%, Mon%, Neu%, Bas% i Eos%. Metoda liczenia impedancji, znana również jako Licznik redlic, stosowany w analizatorach 3-dif, nie jest w stanie rozróżnić neutrofili, bazofilów i eozynofili, dlatego w analizatorach 5-dif stosuje się inną metodę różnicowania komórek. Opiera się na zasadzie dyfrakcja promieniowanie laserowe na komórki leukocytów i dalsza analiza promieniowania rozproszonego. „Średnie” leukocyty nie różnią się na tyle wielkością, aby można je było odróżnić metodą impedancji, ale mają inną strukturę wewnętrzną i inaczej oddziałują z barwnikami. A metoda wykrywania wzoru dyfrakcyjnego okazuje się być wrażliwa na wewnętrzną strukturę komórek. W ten sposób erytrocyty i płytki krwi są zliczane przez licznik Coulter, a leukocyty przez oddzielną jednostkę laserową.

Praca 8. Ilościowe oznaczanie białka w surowicy krwi

4. Skład i właściwości złożonych białek

Praca 9. Charakter chemiczny hemprotein

Praca 10. Identyfikacja węglowodanowego składnika glikoprotein

Praca 11. Jakościowe reakcje na fosfoproteiny

Praca 12. Ilościowe oznaczanie zawartości kwasów sialowych w surowicy krwi metodą Hessa

Praca 13. Chemiczna natura nukleoprotein

Kwasy nukleinowe

1. Badanie natury chemicznej kwasów nukleinowych

Praca 14. Jakościowe reakcje na składniki kwasu nukleinowego

Metody ilościowe oznaczania kwasów nukleinowych

Praca 15. Spektrofotometryczna metoda ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych według A.S. Spirin

Praca 16. Fotokolorymetryczne metody ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych

Praca 17. Badanie fosfolipidów

Praca 18. Jakościowe reakcje na sterydy

Enzymy

Działanie porównawcze enzymów i katalizatorów niebiologicznych

Praca 19. Porównanie działania α-amylazy śliny i kwasu solnego na reakcję hydrolizy skrobi

2. Identyfikacja enzymów należących do różnych klas

Praca 20. Wykrywanie oksydoreduktaz w materiale biologicznym

Praca 21. Wykrywanie cholinesterazy

W surowicy krwi metodą ekspresową Herzfelda i Stumpfa

Praca 22. Oznaczanie aktywności aldolazy fruktozo-1,6-bisfosforanowej w surowicy krwi metodą V.I.Tovarnitsky'ego i EN.Voluyskaya

Budowa wykresu kalibracyjnego

Praca 23. Oznaczanie izomerazy glukozofosforanowej

W surowicy krwi

3. Badanie właściwości kinetycznych enzymów

Praca 24. Kinetyka reakcji enzymatycznych na przykładzie α-amylazy śliny

4. Specyfika działania enzymów

Praca 25. Wykazanie bezwzględnej specyficzności substratowej

5. Modyfikatory aktywności enzymów

Praca 27. Aktywatory i inhibitory α-amylazy ślinowej

tkanka mięśniowa

Praca 29. Niekonkurencyjne hamowanie katalazy krwi

6. Kwantyfikacja aktywności enzymatycznej

Praca 30. Badanie ilościowe aktywności dehydrogenazy mleczanowej leku według Kornberga

Praca 31. Fotokolorymetryczna metoda badania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w surowicy krwi wg Sevela i Tovarka

Praca 32. Oznaczanie aktywności fosfatazy alkalicznej w surowicy krwi według Bodansky'ego

7. Badanie izoenzymów

Praca 33. Rozdzielanie izoenzymów dehydrogenazy mleczanowej surowicy krwi metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym wg Dietza i Lubrano

Praca 34. Oznaczanie aktywności γ-glutamylotransferazy w surowicy krwi

Biochemia trawienia

Praca 35. Badanie kwaśnych składników soku żołądkowego

Praca 36. Oznaczanie kwasowości soku żołądkowego za pomocą zestawu diagnostycznego „Acidotest”

Praca 37. Hydroliza białek przez enzymy przewodu pokarmowego

Praca 38. Badanie dynamiki hydrolizy triacylogliceroli pod wpływem lipazy trzustkowej

Wymiana energii (bioenergia)

1. Badanie biologicznych procesów utleniania w tkankach zwierzęcych Praca 39. Wykrywanie oksydazy cytochromowej w tkance mięśniowej

Praca 40. Demonstracja procesu fosforylacji oksydacyjnej i działania na niego rozprzęgaczy

Praca 41. Wykrywanie glikolizy w tkance mięśniowej

Praca 42. Analiza nukleotydów adeninowych metodą chromatografii cienkowarstwowej jonowymiennej

Praca 43. Oznaczanie aktywności fosfokinazy kreatynowej w surowicy krwi wg Ennor i Rosenberg

Analiza pigmentów i procesów oksydacyjnych organizmów fotosyntetycznych

Praca 44. Jakościowe reakcje na barwniki roślinne

Praca 45. Oznaczanie aktywności peroksydazy w materiale roślinnym metodą A.N. Boyarkina

Metabolizm węglowodanów

Praca 46. Oznaczanie glukozy we krwi

Praca 47. Ilościowe oznaczanie glukozy we krwi metodą oksydazy glukozowej

Praca 48. Oznaczanie zawartości kwasu mlekowego we krwi według Barkera i Summersona

Praca 49. Oznaczanie zawartości kwasu pirogronowego we krwi według Friedemanna i Haugena

metabolizm lipidów

Praca 50

Praca 51

Praca 52. Oznaczanie cholesterolu w surowicy krwi metodą Ilk

Praca 53. Oznaczanie zawartości fosfolipidów całkowitych w surowicy krwi

Praca 54. Oddzielanie lipidów surowicy krwi metodą chromatografii cienkowarstwowej

Metabolizm białek i aminokwasów

Praca 55. Oznaczanie zawartości frakcji białkowych surowicy krwi metodą turbidymetryczną

Praca 56. Oznaczanie aktywności katepsyn w surowicy krwi według A.A. Pokrovsky'ego, A.I. Archakov i O.N.

Katepsyny

Praca 57. Oznaczanie aktywności aminotransferazy asparaginianowej i alaninowej w surowicy krwi wg Reitmana i Frenkla

Praca 58. Oznaczanie aktywności histydazy w surowicy krwi według Tabora i Mehlera w modyfikacji V.A.

Praca 59. Oznaczanie zawartości wolnej hydroksyproliny w moczu wg Neumanna i Logana w modyfikacji p.

Metabolizm substancji niebiałkowych zawierających azot

1. Badanie powszechnych produktów metabolizmu azotu

Praca 60. Ilościowe oznaczanie azotu resztkowego we krwi metodą fotokolorymetryczną

Praca 61. Ilościowe oznaczanie mocznika w surowicy krwi i moczu

Praca 62. Ilościowe oznaczanie kreatyny i kreatyniny metodą Browna

2. Badanie wymiany kwasów nukleinowych i nukleotydów

Praca 63. Oznaczanie aktywności kwaśnej dezoksyrybonukleazy (dnCase) w surowicy krwi wg A.A.

Praca 64. Oznaczanie zawartości kwasu moczowego w surowicy krwi metodą Mullera i Seiferta

3. Badanie metabolizmu porfiryny (pigmentu)

Praca 65. Oznaczanie bilirubiny i jej frakcji w surowicy krwi wg Yendrashika, Cleghorna i Grofa

Patologia molekularna

1. Ekspresowa diagnostyka patologii metabolizmu aminokwasów Praca 66. Wykrywanie hiperaminoacydurii

Praca 67. Ekspresowe metody diagnozowania fenyloketonurii

Praca 68. Diagnostyka tyrozynozy Test Millona dla tyrozyny

Praca 69. Wykrywanie alkaptonurii testem na kwas homogentyzynowy

Praca 70

2. Ekspresowa diagnostyka patologii gospodarki węglowodanowej Praca 71. Wykrywanie pentozurii testem Biala

Praca 72. Wykrywanie fruktozurii testem Selivanova

Praca 73. Wykrywanie mukopolisacharydoz testem z błękitem toluidynowym dla mukopolisacharydów

Praca 74. Oznaczanie zawartości porfobilinogenu w moczu

Praca 75. Ilościowe oznaczanie zawartości kwasu delta-aminolewulinowego w moczu

Praca 76

Regulatory metaboliczne

1. Badanie witamin Praca 77. Jakościowe reakcje na witaminy

Praca 78. Oznaczanie zawartości tiaminy i ryboflawiny metodą fluorymetryczną w preparatach multiwitaminowych

Praca 79. Ilościowe oznaczanie kwasu askorbinowego w roślinach leczniczych

2. Badania nad hormonami, mediatorami i ich metabolitami

Praca 80. Reakcje jakościowe na hormony białkowo-peptydowe.

Praca 81. Jakościowe reakcje na hormony - pochodne aminokwasów

Praca 82. Reakcje jakościowe na hormony steroidowe i ich metabolity

Praca 83. Regulacja poziomu insuliny i adrenaliny glukozy we krwi zwierząt

Praca 84. Ilościowe oznaczanie histaminy we krwi diazowaną n-nitroaniliną według N.V. Klimkiny i S.I. Plitmana

Badanie płynów biologicznych

1. Biochemiczne badania krwi Praca 85. Oznaczanie zawartości hemoglobiny we krwi poprzez jej pochłanianie światła

Praca 86. Oznaczanie zawartości hemoglobiny płodowej w ludzkich erytrocytach

Praca 87. Oznaczanie zawartości hemoglobiny glikozylowanej w erytrocytach metodą fotokolorymetryczną

Praca 88. Oznaczanie stężenia haptoglobin w surowicy krwi metodą fotokolorymetryczną

Praca 89

Praca 90. ​​Oznaczanie aktywności α-amylazy w surowicy krwi metodą amyloklastyczną

Praca 91. Oznaczanie zawartości wapnia w surowicy krwi metodą mureksydową

Praca 92. Próba tymolowa według Huergo i Poppera

Praca 93. Reakcja sublimacyjno-osadowa

Praca 94. Ilościowe oznaczanie zawartości żelaza w surowicy krwi

2. Biochemiczne badanie moczu

Praca 95. Badanie właściwości fizykochemicznych moczu

Praca 96. Oznaczanie ciał ketonowych i glukozy w moczu

Praca 97. Oznaczanie białka w moczu metodą Brandenberga-Robertsa-Stolnikowa

Praca 98. Jakościowe oznaczanie indican w moczu

Praca 99. Wykrywanie niektórych barwników w moczu.

Metabolizm ksenobiotyków

Badanie procesów utleniania i koniugacji ksenobiotyków Praca 100. Ujawnienie aktywności oddechowej mikrosomów

Praca 101. Badanie n-demetylacji oksydacyjnej w mikrosomach wątroby według Our

Praca 102. Oznaczanie aktywności hydroksylazy mikrosomów wątrobowych według Kato i Gilet

Praca 103

Praca 104. Oznaczanie aktywności dehydrogenazy alkoholowej w surowicy krwi według Shkursky et al.

Praca 105

Praca 106. Wykrywanie acetylacji (inaktywacji) hydrazydu kwasu izonikotynowego (gink) w organizmie

Badanie peroksydacji lipidów błon biologicznych

Praca 107. Oznaczanie wrażliwości erytrocytów na hemolizę nadtlenkową

Praca 108. Wyznaczanie tempa peroksydacji lipidów w błonach biologicznych

Aplikacja

2. Biochemiczne wskaźniki osocza krwi

1. Ogólne normy kliniczne

2. Specjalne badanie moczu

Sok żołądkowy

2. Bufor fosforanowy (0,1 m, pH 5,8-8,0)

3. Bufor Tris (0,1 m, pH 7,1-9,2)

4. Bufor octanowy (0,2 m, pH 3,6-5,8)

5. Bufor glicynowy (0,05 m, pH 8,6-10,6)

3. Przygotowanie niektórych odczynników

Spis treści

2. Bufor fosforanowy (0,1 m, pH 5,8-8,0)

Na2HPO4 0,2 M, ml	Na2H2PO4 0,2 M, ml

3. Bufor Tris (0,1 m, pH 7,1-9,2)

W kolbie miarowej o pojemności 1 l (w 500 ml H2O) rozpuszcza się 24,2 g tris-(hydroksymetylo)aminometanu. Aby uzyskać wymaganą wartość pH, dodaje się objętość 1 M HCl wskazaną w tabeli i dostosowuje objętość do 1000 ml za pomocą wody destylowanej.

4. Bufor octanowy (0,2 m, pH 3,6-5,8)

Octan sodu 0,2 M, ml	Kwas octowy 0,2 M, ml		Octan sodu 0,2 M, ml	Kwas octowy 0,2 M, ml

5. Bufor glicynowy (0,05 m, pH 8,6-10,6)

Wskazane objętości glicyny i wodorotlenku sodu miesza się i objętość doprowadza się wodą destylowaną do 200 ml.

	Glicyna 0,2 M, ml	0,2 M NaOH, ml*		Glicyna 0,2 M, ml	0,2 M NaOH, ml*

3. Przygotowanie niektórych odczynników

Aktywacja rozwiązania. W kolbie miarowej o pojemności 100 ml umieszcza się 155 mg zredukowanego glutationu i 400 mg krystalicznej albuminy, rozpuszcza się je w 50 ml wody destylowanej i ustawia pH na 8,2 za pomocą 1 M roztworu NaOH. Następnie dodaj wodę do kreski.

Roztwór amoniaku azotanu srebra. Stężony roztwór amoniaku dodaje się do 2-3% roztworu srebra aż do rozpuszczenia osadu.

Bufor octanowy pH 3,6. Przygotować mieszając 463 ml roztworu A i 37 ml roztworu B, rozcieńczyć do kreski wodą w kolbie miarowej do 1 litra. Roztwór A: Rozcieńczyć wodą 11,55 ml lodowatego kwasu octowego w kolbie pomiarowej o pojemności 1 litra. Roztwór B: Rozpuścić 27,2 g octanu sodu w wodzie w 1-litrowej kolbie.

Odczynnik biuretowy (odczynnik Benedykta). 173 g cytrynianu sodu i 100 g węglanu sodu rozpuszcza się w 300 ml wody destylowanej w łaźni wodnej. Oddzielnie 17,3 g siarczanu miedzi rozpuszcza się w 300 ml wody. Oba roztwory są spuszczane, a całkowita objętość jest doprowadzana do 1 litra.

roztwór buforowy. 2,76 g Veronalu i 2,06 g Medinal rozpuszcza się w 1 litrze wody destylowanej. Przechowywać w lodówce, jeśli pojawi się osad, roztwór nie nadaje się do użycia.

zawieszenie węgla. 0,25 g węgla aktywowanego umieszcza się w 100 ml kolbie miarowej i rozcieńcza buforem octanowym o pH 3,6. Dobrze wstrząsnąć przed użyciem.

Odczynnik redukujący. 1% roztwór kwasu askorbinowego przygotowany z 0,016% roztworem siarczanu miedzi.

Hemoglobina, 4% roztwór w buforze octanowym (pH 4,0). Najpierw przygotowuje się 8% roztwór hemoglobiny w 8 mol/l roztworze mocznika, trzyma przez 2 godziny w termostacie w 60°C i rozcieńcza 2 razy buforem octanowym przed użyciem.

Glicylo-glicyna. 0,55 mmol/l, pH 8,3. 3,63 g glicyloglicyny umieszcza się w 50 ml kolbie miarowej, uzupełnionej wodą do kreski (roztwór buforowy).

Roztwór denaturujący

Odczynnik Diazo do oznaczania bilirubiny. Przygotuj dwa rozwiązania. Pierwszy roztwór: 3 g kwasu sulfanilowego rozpuszcza się w 500 ml wody destylowanej, dodaje 15 ml stężonego kwasu solnego (w gorącej kąpieli), objętość doprowadza się do 1 litra wodą. Drugi roztwór: 0,5% wodny roztwór azotynu sodu. Przed użyciem wymieszać 5 ml pierwszego roztworu i 0,25 ml drugiego.

Diacetyl, roztwór roboczy. 1 ml diacetylu rozcieńcza się wodą destylowaną w 100 ml kolbie miarowej (roztwór przechowuje się w lodówce). Roztwór roboczy diacetylu przygotowuje się przed użyciem przez dodanie 24 ml wody destylowanej do 1 ml roztworu podstawowego diacetylu.

Odczynnik difenyloaminowy. 1 g difenyloaminy rozpuszcza się w 100 ml lodowatego kwasu octowego. Do roztworu dodaje się 2,75 ml stężonego kwasu siarkowego.

Roztwór kalibracyjny. Zasadowy - 0,75 mmol/l ALA (100 ug/ml) w przeliczeniu na zasadę: 0,00635 g chlorowodorku ALA rozpuszczono w buforze octanowym o pH 3,6 w 50 ml kolbie miarowej. Przechowywać w lodówce nie dłużej niż miesiąc. Roboczy roztwór kalibracyjny przygotowuje się z roztworu głównego, 1 μg / ml. Przygotować przed użyciem przez 100-krotne rozcieńczenie roztworu podstawowego buforem octanowym.

Roztwór kalibracyjny. 22,5 mg dihydroksyacetonu rozpuszcza się w 25 ml wody podczas ogrzewania. 1 ml tego roztworu zawiera 10 μmoli dihydroksyacetonu. Roztwór kalibracyjny dihydroksyacetonu wlewa się do szeregu probówek (patrz praca), dopełnia do wymaganej objętości, a następnie reakcję prowadzi się w taki sam sposób, jak przy oznaczaniu aktywności enzymu.

Kalibracyjny (standardowy) roztwór żelaza (30 µmol/l).

Sole Mora są przygotowywane jako pierwsze.

odczynnik kofeinowy. 1 g czystej kofeiny, 7,5 g benzoesanu sodu, 12,5 g octanu sodu rozpuszcza się w 90 ml wody destylowanej, ogrzewa do 50-60°C, miesza, schładza i uzupełnia do 100 ml wodą destylowaną.

Molibdenian amonu w kwasie azotowym. 7,5 g molibdenianu amonu rozpuszcza się w 100 ml wody i dodaje 100 ml 32% kwasu azotowego.

Mocz na alkaptonurię. W przypadku braku patologii hydrochinon dodaje się do normalnego moczu w ilości 20 g/l.

Mocz z hiperaminoacydurią. W przypadku braku patologicznej glicyny dodaje się do prawidłowego moczu w ilości 1,0 g/l.

Mocz z mukopolisacharydozą. W przypadku braku patologii chonsuryd lub heparynę dodaje się do normalnego moczu w ilości 0,05-0,1 g / l.

Mocz z pentosurią. W przypadku braku patologii do moczu dodaje się ksylulozę lub rybozę w ilości 1,0 g/l.

Mocz z tyrozynozą. W przypadku braku patologii tyrozynę dodaje się do normalnego moczu w ilości 0,4-0,5 g / l.

Mocz z fruktozurią. W przypadku braku patologii fruktozę dodaje się do normalnego moczu w ilości 0,3-0,4 g / l.

Mocz na cystynurię. W przypadku braku patologicznej cystyny ​​dodaje się do normalnego moczu w ilości 0,4-0,5 g / l.

3-wodny, nasycony roztwór octanu sodu. 375 g 3-wodnego octanu sodu (lub 226 g bezwodnej soli) rozpuszcza się w 250 ml ciepłej wody ochłodzonej do temperatury pokojowej. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Roztwór powinien być bezbarwny i przezroczysty.

Dwupodstawiony fosforan sodu 0,25 mol/l. Przygotować przez rozpuszczenie 9,7 g Na 2 HPO 4 × 12 H 2 O lub 18 g Na 2 HPO 4 × 12 H 2 O w wodzie w 200 ml kolbie. Przy dodawaniu 2 ml tego roztworu do 1 ml roztworu kwasu trichlorooctowego pH powinno mieścić się w zakresie 5,0-6,0.

Podstawowy roztwór kalibracyjny kreatyniny, 10 mmol/l. 113,1 mg kreatyniny doprowadza się do 100 ml za pomocą 0,1 mol/l roztworu kwasu chlorowodorowego. Podczas konstruowania wykresu kalibracyjnego, roztwór roboczy przygotowuje się z roztworu podstawowego przez 100-krotne rozcieńczenie roztworu podstawowego wodą, przy czym 1 ml roztworu zawiera 0,1 mmol kreatyniny. Na tej podstawie otrzymuje się szereg probówek z odpowiednimi stężeniami kreatyny.

Mieszanina utleniająca do oznaczania tiaminy. Do 8 ml 1% heksacyjanożelazianu (III) potasu dodaje się 20 ml 30% roztworu NaOH, dokładnie miesza. Przygotuj przed użyciem.

Odczynnik Orcyny. Do 1 g orcyny dodać 500 ml 30% kwasu solnego (gęstość 1,15 g/cm 3). Mieszać do rozpuszczenia i dodać 4-5 ml 10% roztworu chlorku żelaza (III) FeCl3. Odczynnik jest przechowywany w szczelnie zamkniętej ciemnej butelce.

Podstawowy roztwór kalibracyjny p-nitroaniliny. 0,0829 g p-nitroaniliny umieszcza się w 100 ml kolbie miarowej, dopełnia wodą do kreski i rozpuszcza.

Strącający roztwór. Rozpuścić 561 g siarczanu amonu w 1 litrze wody destylowanej i przefiltrować po 24 godzinach.

Zasadowy bufor fosforanowy i jego roztwory robocze nr 1-4. W kolbie miarowej o pojemności 500 ml rozpuścić 33,5 g NaOH w 400 ml wody i dodać 226,8 g KH 2 PO 4 , wstrząsnąć do całkowitego rozpuszczenia, ostudzić i dodać wodę do kreski. W celu przygotowania roztworów roboczych zasadowego buforu fosforanowego do kolb miarowych o pojemności 100 ml odmierza się następujące objętości zasadowego buforu fosforanowego (w ml): nr 1 - 92,51; nr 2 - 74,91; nr 3 - 59.18 i nr 4 - 48.68, po czym ich zawartość doprowadza się do kreski wodą.

Kwas pikrynowy, roztwór nasycony. Towar kwas pikrynowy zawiera 15-20% wilgoci, nie należy suszyć kwasu. Materiał wybuchowy! Rozpuścić 2 g kwasu pikrynowego w 100 ml wody, ogrzewając w gorącej łaźni. Następnie roztwór odstawia się na 24 godziny, od czasu do czasu mieszając. Roztwór jest następnie filtrowany. Roztwór jest stabilny i przechowywany w pojemniku z ciemnego szkła.

Bufor pirofosforanowy 0,05 M pH 8,2. Przenieść 4,46 g pirofosforanu sodu do 200 ml kolby miarowej, rozpuścić w około 100 ml wody, dostosować pH 0,1 M roztworem HCl do 8,2 i uzupełnić wodą destylowaną do kreski.

Bufor pirofosforanowy 0,1 M pH 8,5. Do kolby miarowej o pojemności 100 ml przenieść 4,46 g pirofosforanu sodu, rozpuścić w 50 ml wody, dostosować pH 0,1 M roztworem HCl do 8,5 i dodać wodę destylowaną do kreski.

Odczynnik roboczy. Przygotować w dniu oznaczenia mieszając 30 części 0,3 N wodorotlenku sodu. 2 części 0,5% roztworu fenoloftaleiny i 1 część 0,12% roztworu siarczanu miedzi.

Roztwór cyjanohydryny w acetonie. Rozpuścić 1 ampułkę cyjanohydryny acetonu (0,5 ml - 0,47 g z zestawu do oznaczania hemoglobiny we krwi) w 1 litrze wody destylowanej.

Roztwór cyjanohydryny żelazoacetonu. Rozpuścić 200 mg żelazicyjanek potasu i 1 ampułkę (0,5 ml - 0,47 g) cyjanohydryny acetonu w 1 litrze wody destylowanej: z zestawu odczynników można użyć do przygotowania roztworu transformującego do oznaczania hemoglobiny we krwi. Stabilny przez kilka miesięcy przy przechowywaniu w pojemniku z ciemnego szkła w temperaturze pokojowej.

Roztwór gluoksydazy. Zawiera około 300 jednostek. w 1 mg. Przygotuj rozpuszczając odpowiednią ilość suchego preparatu w 10 ml wody.

Roztwór sulfonowanej bato-fenantroliny. W probówce 0,5 ml kwasu chlorosulfonowego dodaje się do 100 mg batofenantroliny, ogrzewa we wrzącej łaźni wodnej przez 30 s, chłodzi i powoli dodaje 10 ml wody podwójnie destylowanej, ponownie ogrzewa w łaźni wodnej przez 5 minut. Mieszaninę przenosi się do 200 ml kolby, dodaje 100 ml wody, pH roztworu doprowadza do 4-5 N NaOH i dodaje wodę do objętości 200 ml.

Roztwór jodu w jodku potasu (roztwór Lugola). Rozpuść 20 g jodku potasu i 10 g jodu w 100 ml wody destylowanej. Przed użyciem roztwór rozcieńcza się 5 razy.

Roztwór p-nitrozodimetyloaniliny (NDMA). Dostępny w handlu preparat NDMA rekrystalizuje się z eteru etylowego. Aby zmierzyć dehydrogenazę alkoholową, 1 mg NDMA rozpuszcza się w 100 ml 0,1 M buforu pirofosforanowego (pH 8,5). Powstały roztwór filtruje się przez filtr papierowy i filtrat rozcieńcza się 2 razy tym samym buforem. Przechowywać w 4°C przez dwa miesiące.

Odczynnik Ilki. Do 5 części (objętościowo) bezwodnika octowego dodać 1 część lodowatego kwasu octowego, a następnie stopniowo wlewać 1 część stężonego kwasu siarkowego. Przechowuj odczynnik na zimno!

Odczynnik Millona. (Gotowy pod presją! ) 40 g rtęci rozpuszcza się w 57 ml stężonego kwasu azotowego najpierw na zimno, a następnie ogrzewa w łaźni wodnej. Otrzymany roztwór rozcieńcza się 2 objętościami wody, pozostawia do osadzenia i odsącza z osadu. Przechowywać w ciemnej szklanej butelce.

Odczynnik molibdenianu amonu. 2,5 g molibdenianu amonu rozpuszcza się w 60 ml wody destylowanej, sączy. Roztwór dodaje się do kolby o pojemności 100 ml. W innej kolbie 7,5 ml stężonego kwasu siarkowego dodaje się do 25 ml wody destylowanej. Drugi roztwór dodaje się do pierwszego, schładza i rozcieńcza wodą destylowaną do kreski. Rozwiązanie nadaje się na miesiąc.

Odczynnik "NADI". 1% roztwór dimetylo-p-fenylenodiaminy miesza się z równą objętością 1% roztworu α-naftolu w alkoholu i 1,5% roztworu węglanu sodu. Roztwór ma kolor ciemnobrązowy i nie powinien mieć różowego odcienia. Przygotowany 1 godzinę przed zajęciami.

Odczynnik Nasha. Do kolby o pojemności 100 ml dodaje się 15,4 g octanu amonu, 0,3 g lodowatego kwasu octowego i 0,2 g acetyloacetonu, rozpuszcza się w wodzie destylowanej i dopasowuje objętość do kreski.

odczynnik Nesslera. W kolbie miarowej o pojemności 500 ml miesza się 150 g jodku potasu, 110 g jodu, 100 ml wody destylowanej i około 140-150 g rtęci metalicznej i energicznie wstrząsa przez 15 minut. W takim przypadku roztwór samorzutnie się nagrzewa, a kolor z powodu rozpuszczonego jodu stopniowo blednie. Mieszaninę następnie schładza się pod bieżącą wodą, aż utrzyma się wyraźny czerwony kolor, po czym zawartość wytrząsa się, aż czerwony kolor zmieni się na zielonkawy. Po dekantacji osad rtęci dokładnie przemywa się wodą. Połącz roztwór i popłuczyny, rozcieńcz je wodą do 2 litrów. Umieścić 75 ml otrzymanego roztworu w 0,5 l kolbie pomiarowej zawierającej 75 ml wody i 350 ml 10% roztworu wodorotlenku sodu i rozcieńczyć wodą do kreski.

Odczynnik Fehlinga. Dwa roztwory przygotowywane są oddzielnie. Roztwór 1: Rozpuść 200 g soli Rochelle i 150 g NaOH w kolbie miarowej o pojemności 1 l i rozcieńcz wodą do kreski. Roztwór 2: w kolbie miarowej o pojemności 1 l rozpuścić 40 g siarczanu miedzi (II) w wodzie i rozcieńczyć wodą do kreski. Wymieszać równe objętości tych roztworów przed użyciem.

odczynnik Folina. W kolbie o pojemności 1 litra rozpuścić 1 g wolframianu sodu i 20 g kwasu fosfomolibdenowego w 750 ml wody. Zamknąć kolbę korkiem z chłodnicą zwrotną i po włączeniu przepływu wody w lodówce zawartość gotuje się przez 10 godzin; następnie chłodzi się, wlewa do kolby miarowej i objętość wodną odczynnika doprowadza się do 1 litra.

odczynnik Erlicha. 0,7 g p-dimetyloaminobenzaldehydu rozpuszcza się w 150 ml stężonego kwasu solnego, dodaje do 100 ml wody i miesza. Roztwór powinien być bezbarwny lub lekko żółty. Przechowywać w pojemniku z ciemnego szkła. Odczynnik jest stabilny.

odczynnik Erlicha. Rozpuścić 1 g p-dimetyloaminobenzaldehydu w 50 ml kolbie miarowej w 35 ml lodowatego kwasu octowego, dodać 8 ml 57% kwasu nadchlorowego i uzupełnić do kreski lodowatym kwasem octowym. Przechowywać w ciemnym szklanym pojemniku w lodówce do tygodnia.

Alkohol tymolowy roztwór (10%). 10 g oczyszczonego tymolu rozpuszcza się w 100 ml 96-procentowego alkoholu etylowego. Otrzymywanie oczyszczonego tymolu prowadzi się w następujący sposób. 100 g tymolu rozpuszcza się w 100 ml 96-procentowego alkoholu etylowego, sączy. Do filtratu dodać 1 litr zimnej wody destylowanej, energicznie wstrząsnąć i odstawić na 20 minut. Filtr jest filtrowany, a kryształy pozostające na filtrze przemywa się dwukrotnie zimną wodą destylowaną. Wysuszyć najpierw na bibule filtracyjnej, a następnie przez 2-3 dni w eksykatorze nad bezwodnym chlorkiem wapnia do stałej masy.

Standardowe rozwiązanie. Przygotowanie roztworu wzorcowego przeprowadza się przez zmieszanie dwóch roztworów: 1) 0,0962 n roztwór chlorku baru: 1,175 g krystalicznego BaCl2 2H2O rozpuszcza się w 100 ml wody w kolbie miarowej. 2) 0,2 N roztwór kwasu siarkowego. Następnie otrzymuje się zawiesinę siarczanu baru: 3 ml 0,0962 N roztworu chlorku baru wlewa się do 100 ml kolby miarowej i dopasowuje objętość 0,2 N roztworem kwasu siarkowego w temperaturze + 10 ° C ( w tej temperaturze rozmiary cząstek wytrąconego siarczanu baru dają względnie stabilny wynik).

Roztwór buforu podłoża: wlać 10 ml wody do probówki i dodać 0,028 g L-glutamylo-p-nitroaniliny oraz 0,082 g chlorku sodu i nie przestając mieszać rozpuścić zawartość probówki we wrzącej łaźni wodnej przez 60 sekund . Następnie roztwór schładza się do 37°C i dodaje 2,5 ml roztworu buforowego. Przygotowany roztwór substratu jest przechowywany w łaźni wodnej w temperaturze 37°C podczas pracy. Niewykorzystany roztwór substratu można przechowywać w lodówce do tygodnia. Podłoże jest słabo rozpuszczalne i wytrąca się w temperaturze pokojowej. Dlatego przed użyciem skrystalizowany substrat rozpuszcza się przez ogrzewanie we wrzącej łaźni wodnej. Ogrzewanie i rozpuszczanie podłoża można powtórzyć nie więcej niż dwa razy.

Roztwór substratu do oznaczania ALT (roztwór nr 1). Próbki 29,2 mg kwasu α-ketoglutarowego i 1,78 g alaniny (0,89 g α-alaniny) odważa się na wadze analitycznej i rozpuszcza w 1 M roztworze wodorotlenku sodu aż do całkowitego rozpuszczenia osadu (pH 7,4). Roztwór wlewa się do 100 ml kolby i objętość doprowadza się do oznaczenia 0,1 M buforem fosforanowym (pH 7,4). Dodaj 1 kroplę chloroformu. Roztwór przechowuje się zamrożony w lodówce.

Roztwór podłoża do oznaczania AsAT (roztwór nr 2). Próbki 29,2 mg kwasu α-ketoglutarowego i 2,66 g kwasu α-asparaginowego (1,33 g kwasu α-asparaginowego) odważa się na wadze analitycznej. Następnie roztwór przygotowuje się w taki sam sposób jak rozwiązanie nr 1.

Roztwór substratu do oznaczania izomerazy glukozo-fosforanowej. Przygotowano buforowy roztwór octanu medyny o pH 7,4 (9,714 g octanu sodu i 14,714 g medyny rozpuszczono w wodzie i objętość doprowadzono do 500 ml). Zmieszać 8,33 ml 0,03 M roztworu soli disodowej glukozo-6-fosforanu z 25 ml medialnego buforu octanowego; dodać do mieszaniny 25 ml 0,1 M roztworu kwasu chlorowodorowego i rozcieńczyć wodą do 100 ml. Trzymaj zimno.

Roztwór substratu do oznaczania dehydrogenazy mleczanowej. Wymieszać 1 ml 1 M roztworu mleczanu sodu, 9 M roztworu NaCl, 0,05 M Cl 2, 10 g/L roztworu NAD. Do zawartości dodaje się 2,5 ml 0,5 M roztworu buforu fosforanowego (pH 7,4) i 1 g/l roztworu błękitu nitrotetrazoliowego. Przed użyciem do mieszaniny dodaje się 0,25 ml roztworu metasiarczanu fenanzyny o stężeniu 1 g / l.

Roztwór substratu do oznaczania aldolazy fruktozo-bisfosforanowej. 270 mg soli barowej bisfosforanu fruktozy rozpuszcza się w 3,5 ml 1 M kwasu solnego. Dodaje się 1 ml 14% roztworu siarczanu sodu i utworzony osad usuwa się przez odwirowanie. Do supernatantu dodać 1 kroplę siarczanu sodu. Pojawienie się zmętnienia wskazuje na niewystarczająco całkowite odkładanie się jonów baru. W takim przypadku dodaje się więcej siarczanu sodu i ponownie odwirowuje. Odwirowanie doprowadza się 3% roztworem wodorotlenku sodu do pH 7,4-7,6, przenosi do kolby 25 ml i objętość doprowadza się do kreski. Otrzymany roztwór miesza się z 25 ml 0,56 M roztworu chlorku hydrazyny, 25 ml 0,002 M roztworu kwasu monojodooctowego, 100 ml 0,5% roztworu węglanu sodu i 25 ml wody destylowanej. Przechowywany w lodówce.

Bufor tymolowo-weronowy. W 100 ml kolbie miarowej wymieszać 80 ml roztworu buforowego i 1 ml 10% alkoholowego roztworu tymolu, wstrząsnąć i dodać roztwór buforowy do kreski. Wartość pH powinna wynosić 7,55.

Odczynnik o-toluidynowy. 0,15 g tiomocznika rozpuszcza się w 94 ml lodowatego kwasu octowego i miesza z 6 ml destylowanej O-toluidyny. Przechowywany w ciemnej butelce.

Fenol nasycony wodą. Do 100 g destylowanego fenolu dodaje się 35 ml wody i miesza, lekko ogrzewając mieszaninę w celu przyspieszenia rozpuszczenia fenolu.

Fenoloftalen, roztwór roboczy. Przygotować rozpuszczając 75 mg substancji w 15 ml 0,1 N roztworu wodorotlenku sodu, roztwór powinien być bezbarwny lub lekko różowawy, roztwory kolorowe nie nadają się do pracy. Aby zwiększyć odporność odczynnika, dodaje się do niego 3 mg trilonu, który poprzez wiązanie soli metali ciężkich zapobiega samoutlenieniu fenoloftaleiny przez tlen atmosferyczny.

Fibryna. Fibryna krwi bydlęcej jest wypłukiwana z barwników krwi pod bieżącą wodą przez kilka dni, aż do uzyskania białego skrzepu. Woda jest wyciskana, a fibryna wypełniona gliceryną jest przechowywana w szczelnie zamkniętym słoiku. Przed użyciem fibryna jest wypłukiwana z gliceryny.

Odczynnik fosforowo-wanilinowy. 4 części (objętościowe) stężonego kwasu fosforowego miesza się z 1 częścią 0,6% wodnego roztworu waniliny. Odczynnik jest przechowywany w pojemniku z ciemnego szkła w temperaturze pokojowej.

1,6-bisfosforan fruktozy, sól sodowa. 2,0 ml 10% roztworu soli sodowej fruktozo-1,6-bisfosforanu rozcieńcza się wodą do kreski w 25 ml kolbie. Stabilny, gdy jest przechowywany w lodówce.

Odczynnik barwny do mocznika. Tabletkę z zestawu do oznaczania mocznika zawierającą monooksym diacetylu i tiosemikarbazyd rozpuszcza się przez ogrzewanie w kolbie o pojemności 50 ml. Roztwór jest stabilny przez trzy tygodnie. Przed użyciem wymieszać równe objętości przygotowanego roztworu z 9,6% roztworem kwasu siarkowego.

Zasadowy roztwór β-glicerofosforanu. W kolbie miarowej o pojemności 100 ml dodać 1 g β-glicerofosforanu sodu i 0,85 g medinal, dodać około 30 ml wody destylowanej, rozpuścić i dopełnić wodą do kreski. Do innej kolby miarowej o pojemności 100 ml dodać 50 ml przygotowanego roztworu β-glicerofosforanu, 2,8 ml 0,1 M roztworu wodorotlenku sodu i doprowadzić do kreski wodą destylowaną (pH 8,6). Na płyn nałożyć około 3 ml toluenu. Przechowuj roztwór w lodówce nie dłużej niż 10 dni.

Pobieranie krwi, przygotowanie „cienkiego rozmazu” i „grubej kropli”

ruch bakterii. Budowa wici, grubość, długość, skład chemiczny. Wytwarzanie preparatów utrwalonych i preparatów żywych komórek drobnoustrojów.

Do przygotowania roztworów buforowych stosuje się chemicznie czyste odczynniki. i analityczna, specjalnie przygotowana. Odczynniki przygotowuje się w następujący sposób.

Monopodstawiony fosforan potasu, KH 2 PO 4 , masa cząsteczkowa 136,09. 100 g leku rozpuszcza się po podgrzaniu do wrzenia w 150 ml wody. Roztwór filtruje się na gorąco. Przy ciągłym mieszaniu filtrat schładza się do 10 ºС. Następnie dodaj 150 ml alkoholu etylowego. Kryształy oddzielone przy ciągłym mieszaniu przesączu odsączono na lejku ssącym i ponownie przekrystalizowano w tych samych warunkach; kryształy suszy się do stałej masy w temperaturze 105...110 ºС. W obecności preparatu o zawartości substancji głównej w zakresie 99,9 ... 100,0% nie przeprowadza się wstępnego przygotowania substancji.

Dipodstawiony fosforan sodu, Na2HPO4 12H2O, masa cząsteczkowa 358,12. Lek można przygotować na dwa sposoby.

a) 150 g leku rozpuszcza się w 150 ml wody po ogrzaniu do 100°C. Roztwór przesącza się na gorąco i po schłodzeniu odsącza wytrącone kryształy. Rekrystalizacja jest powtarzana przez ogrzewanie do 100 ºС. Zrekrystalizowany preparat ogrzewa się w porcelanowym kubku w łaźni wodnej z ciągłym mieszaniem do całkowitego wyschnięcia preparatu. Otrzymaną sól suszy się w eksykatorze nad stopionym chlorkiem wapnia w ciągu dnia. W prekrystalizowanym preparacie (Na2HPO4 ·2H2O) sprawdzana jest zawartość substancji głównej. W tym celu około 0,5000 g leku rozpuszcza się w 50 ml wody, dodaje się 2 ... 3 ml nasyconego roztworu chlorku sodu i miareczkuje 0,1 N roztworem kwasu solnego w obecności wskaźnika czerwieni metylowej . W razie potrzeby dokonaj korekty wielkości próbki. 1 ml dokładnie 0,1 N kwasu chlorowodorowego odpowiada 0,0178 g Na2HPO4 2H2O.

b) 75 g leku rozpuszcza się w 250 ml wody ogrzanej do 60 ºС. Roztwór filtruje się na gorąco, filtrat chłodzi się przy ciągłym mieszaniu do 10 ºС. Wytrącone kryształy odsączono na lejku ssącym i ponownie przekrystalizowano w tych samych warunkach. Otrzymana sól jest najpierw suszona w temperaturze nieprzekraczającej 30 ºC przez 24 godziny, następnie suszona jest w piecu w 50 ºC przez 3-4 godziny, a na końcu w 120±5 ºC do stałej masy, zapobiegając topienie. Po wysuszeniu sól ma skład Na2HPO4.

Po przygotowaniu odczynników przygotowuje się roztwory podstawowe monopodstawionego fosforanu potasu i dipodstawionego fosforanu sodu.

Porcję bezwodnego monopodstawionego fosforanu potasu KH2PO4 ważącą 9,078 g rozpuszcza się w wodzie i objętość roztworu doprowadza się do 1 litra. Aby ustabilizować roztwór dodać 3-4 krople toluenu.

Porcję dipodstawionego fosforanu sodu Na2HPO4 12H2O, ważącą 11,876 g, rozpuszcza się w wodzie i objętość roztworu doprowadza się do 1 litra. Aby ustabilizować roztwór dodać 3-4 krople toluenu.

Z początkowych roztworów przygotować roztwory buforów fosforanowych o pH od 4,94 do 9,18 zgodnie z Tabelą A.2.

Tabela A.2 - Roztwór buforu fosforanowego o pH 4,94 ... 9,18

pH	roztwór Na2HPO4 12H2O, ml	roztwór KH 2 PO 4, ml
4,94	1,0	99,0
5,29	2,5	97,5
5,59	5,0	95,0
5,91	10,0	90,0
6,24	20,0	80,0
6,47	30,0	70,0
6,64	40,0	60,0
6,81	50,0	50,0
6,98	60,0	40,0
7,17	70,0	30,0
7,38	80,0	20,0
7,73	90,0	10,0
8,04	95,0	5,0
8,34	97,5	2,5
8,67	99,0	1,0
9,18	100,0	0,0

Data dodania: 2015-08-06 | Wyświetlenia: 4058 |

Wartość pH roztworów buforowych oblicza się według równania Hendersona-Hasselbacha:

– dla buforu kwasowego równanie ma postać

– dla bufora głównego

Z równań wynika, że ​​pH roztworu buforowego o danej kompozycji jest określone przez stosunek stężeń kwasu i soli lub zasady i soli, a zatem nie zależy od rozcieńczenia. Gdy zmienia się objętość roztworu, stężenie każdego składnika zmienia się tyle samo razy.

Pojemność bufora

Zdolność roztworów buforowych do utrzymania stałego pH jest ograniczona. Tych. dodanie kwasu lub zasady bez znaczącej zmiany pH roztworu buforowego jest możliwe tylko w ograniczonych ilościach.

Wielkość charakteryzująca zdolność roztworu buforowego do przeciwdziałania zmianom reakcji ośrodka po dodaniu kwasów i zasad nazywana jest pojemnością buforową roztworu (B).

Pojemność buforową mierzy się liczbą równoważników molowych mocnego kwasu lub zasady, których dodanie do 1 litra roztworu buforowego powoduje zmianę pH o jeden.

Matematycznie pojemność buforowa jest zdefiniowana w następujący sposób:

B kwasem (mol/l lub mmol/l):

,

gdzie n(1/z HA) to liczba równoważników molowych kwasu, pH 0 i pH to pH roztworu buforowego przed i po dodaniu kwasu, V B to objętość roztworu buforowego.

W alkaliach (mol/l lub mmol/l):

,

gdzie n (1/z VOH) jest liczbą równoważników molowych zasady, pozostałe oznaczenia są takie same.

Pojemność bufora zależy od wielu czynników:

1. Z charakteru dodanych substancji i składników roztworu buforowego. Dlatego niektóre substancje mogą tworzyć nierozpuszczalne związki lub kompleksy lub dawać inne niepożądane reakcje ze składnikami układu buforowego, wówczas pojęcie pojemności buforowej traci sens.

2. Od początkowego stężenia składników układu buforowego.

Im większa liczba składników pary kwasowo-zasadowej w roztworze, tym większa pojemność buforowa tego roztworu.

Granica stosunku stężeń składników roztworu buforowego, przy której układ nadal zachowuje swoje właściwości. Odstęp pH = pK ± 1 nazywany jest strefą działania buforowego układu. Odpowiada to zakresowi stosunku Z solą /C do Ciebie od 1/10 do 10/1.

B do (krew) \u003d 0,05 mol / l; B do (osocze) \u003d 0,03 mol / l; B do (krew w surowicy) = 0,025 mol/l

Systemy buforowe krwi

Systemy buforowe są szczególnie ważne w utrzymaniu równowagi kwasowo-zasadowej organizmów. Wartość pH większości płynów wewnątrzkomórkowych mieści się w zakresie od 6,8 ​​do 7,8.

Równowagę kwasowo - zasadową we krwi człowieka zapewniają układy buforowe wodorowęglanowe, fosforanowe, białkowe i hemoglobinowe. Normalna wartość pH osocza krwi wynosi 7,40 ± 0,05.

System buforowy hemoglobiny zapewnia 35% pojemności buforowej krwi: . Oksyhemoglobina jest silniejszym kwasem niż zredukowana hemoglobina. Oksyhemoglobina występuje zwykle w postaci soli potasowej.

System buforowy węglanowy : zajmuje pierwsze miejsce pod względem mocy. Jest reprezentowany przez kwas węglowy (H 2 CO 3) i wodorowęglan sodu lub potasu (NaHCO 3, KHCO 3) w stosunku 1/20. Bufor wodorowęglanowy jest szeroko stosowany do korygowania zaburzeń kwasowo-zasadowych w organizmie.

System buforów fosforanowych . Dihydrofosforan ma właściwości słabego kwasu i oddziałuje z produktami zasadowymi, które dostają się do krwiobiegu. Hydrofosforan ma właściwości słabej zasady i reaguje z mocniejszymi kwasami.

Białkowy układ buforowy pełni rolę neutralizującą kwasy i zasady ze względu na swoje właściwości amfoteryczne: w środowisku kwaśnym białka osocza zachowują się jak zasady, w zasadowym - jak kwasy:

W tkankach obecne są również układy buforowe, co przyczynia się do utrzymania pH tkanek na względnie stałym poziomie. Głównymi buforami tkankowymi są białka i fosforany. Utrzymanie pH odbywa się również przy pomocy płuc i nerek. Nadmiar dwutlenku węgla jest usuwany przez płuca. Nerki z kwasicą wydzielają więcej kwaśnego jednozasadowego fosforanu sodu, a z zasadowicą - więcej soli zasadowych: dwuzasadowego fosforanu sodu i wodorowęglanu sodu.

Przykłady rozwiązywania problemów

Rozwiązanie:

Wartość pH roztworu buforowego kwasu obliczamy ze wzoru , a następnie

Odpowiadać: 5,76

Rozwiązanie:

Pojemność buforową obliczamy ze wzoru:

Odpowiadać: 0,021 mol/l

Przykład 3

Roztwór buforowy składa się ze 100 ml 0,1 mol/l kwasu octowego i 200 ml 0,2 mol/l octanu sodu. Jak zmieni się pH tego roztworu, jeśli doda się do niego 30 ml 0,2 mol/l roztworu wodorotlenku sodu.

Rozwiązanie:

Wartość pH roztworu buforowego obliczamy ze wzoru:

Po dodaniu NaOH do roztworu buforowego ilość soli wzrasta, a ilość kwasu w roztworze buforowym maleje:

0,006 0,006 0,006

CH 3 COOH + NaOH \u003d CH 3 COONa + H 2 O

Obliczamy n (NaOH) \u003d 0,03 l 0,2 mol / l \u003d 0,006 mola, dlatego w roztworze buforowym ilość kwasu zmniejsza się o 0,006 mola, a ilość soli wzrasta o 0,006 mola.

Wartość pH roztworu obliczamy za pomocą wzoru:

Stąd: pH 2 - pH 1 = 5,82 - 5,3 = 0,52

Odpowiadać: zmiana pH buforu = 0,52.

Zadania do samodzielnego rozwiązania

4. W celu zmiareczkowania 2 ml krwi w celu zmiany pH z wartości początkowej (7,36) do wartości końcowej (7,0) konieczne było dodanie 1,6 ml 0,01 M roztworu HCl. Oblicz pojemność buforową kwasu.

5. Ile moli octanu sodu należy dodać do 300 ml kwasu octowego, aby 300-krotnie zmniejszyć stężenie jonów wodorowych (Kdis (CH 3 coon) = 1,85,10 -5).

6. W badaniach biochemicznych stosuje się bufor fosforanowy o pH = 7,4. W jakim stosunku należy mieszać roztwory wodorofosforanu sodu i diwodorofosforanu sodu o stężeniu 0,1 mol / l każdy w celu uzyskania takiego roztworu buforowego (pK (H 2 PO 4 -) \u003d 7,4).

7. Jakie naruszenia CBS obserwuje się za pomocą następujących wskaźników: pH krwi = 7,20, Pco 2 = 38 mm Hg. Art., BO = 30 mmol / l, SBO = -4 mmol / l. Jak wyeliminować to naruszenie KOS?

Zadania testowe

Bufor fosforanowy Tween-20 do płukania immunohistochemicznego to koncentrat (20x), który po rozcieńczeniu służy do płukania szkiełek odczynników i krótkotrwałego przechowywania próbek immunohistochemicznych między procedurami. Po rozcieńczeniu gotowy do użycia roztwór 0,01 M ma pH 7,4±0,1. Zastosowanie tej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami pozwala nie tylko zapewnić wysokiej jakości płukanie, ale także zachować cechy morfologiczne stosowanych przeciwciał i ich epitopów, co ułatwia specyficzne wiązanie wymagane do reakcji immunohistochemicznej. Dodanie Tween-20 do PBS sprzyja bardziej wydajnemu praniu i zapobiega nieswoistym plamom.

Nasze atuty:

W chwili obecnej współpracujemy z czołowymi zagranicznymi producentami odczynników laboratoryjnych. Naszymi klientami są zarówno instytucje niepaństwowe, jak i państwowe, w tym organizacje medyczne w Moskwie i innych miastach Rosji. Dla stałych klientów obowiązuje system rabatów.