Krav på insamling och beredning av biologiskt material för hematologiska studier.

Krav på transport och lagring av biologiskt material för hematologiska studier.

Korrekt fyllning av riktningen för studien av hemostassystemet:

Patientens fullständiga namn, ålder, kön

Tid för blodprov för forskning

Klinisk diagnos (kortfattat)

Hematokrit

Hemorragiskt syndrom (näsa, livmoderblödning, etc.), trombos (indikerar lokalisering), chock, multipel organsvikt, trauma, förlängt kompressionssyndrom, brännskador, etc.)

Ange vilka läkemedel som tagits som påverkar parametrarna för hemostas, och ange dosering, metod och datum för senaste administrering

Tidsintervallet för provtagning (blod), kost- och träningsrestriktioner observeras:

Schemalagd blodprovstagning utförs från klockan 7 till 9 på morgonen, med patienten liggande eller sittande. När man studerar hemostas i dynamik är det önskvärt att ta blod i samma position i kroppen som den föregående.

Blod tas på fastande mage, 12-14 timmar efter den sista måltiden.

Innan du tar blod är det önskvärt att patienten vilar i 15 minuter.

Undantag: studier av hemostas av cito, bedömning av APTT.

På tröskeln till en planerad studie (inom 24 timmar) avstår patienten från betydande fysisk ansträngning, alkoholintag. Det är önskvärt att patienten inte äter fet mat på tröskeln till blodprovstagning.

Kirurgiskt ingrepp leder till en förändring i hemostas under en period av flera dagar till flera veckor.

Faktorer som påverkar e hemostas inkluderar injektioner, infusioner, transfusioner, punkteringar, biopsier, massage, dialys, införande av radiopaka medel, immunoscintiografi, joniserande strålning, endoskopisk undersökning, specialdieter.

REGLER FÖR BLODPROVTAGNING

Blod tas från en perifer ven (vanligtvis cubital).

Blodprovtagning utförs endast med hjälp av ett vakuumprovtagningssystem i provrör med en speciell färgmärkning beroende på vilket antikoagulant som används ( natriumcitrat 3,2 %) i förhållandet: 1 volym natriumcitrat till 9 volymer blod.

För forskning blodplättsnivåer ta blod i ett provrör med EDTA(lila färgkodning). Studien av nivån av blodplättar föreskrivs i avsaknad av ett kliniskt blodprov eller när patologiska värden på blodplättsnivån erhålls i ett kliniskt blodprov

En kort turnering är tillåten, inte mer än 60 sekunder. Ta bort tourniqueten omedelbart efter att nålen har kommit in i venen. För blodprovstagning för studien av koagulationssystemet är det viktigt att du inte kan massera venerna, knacka på dem.

Använd en bloduppsamlingsnål med en innerdiameter på 0,7-1 mm (storlek 19-22).

Användningen av en spruta är oacceptabel på grund av aktiveringen av blodplättar och blodkoaguleringsfaktorer genom den turbulenta rörelsen av blod och dess blandning med luft (skumbildning). Det är uteslutet vid användning av vakuumbehållare.

Efter att ha fört in nålen i venen, fäst vakuumbehållaren, blodet kommer att börja rinna in i behållaren genom gravitationen.

Ta blod för koagulologisk undersökning andra provrör, första användning för andra studier, till exempel biokemiska. Om koagulationsprovröret ska dras först, dra upp de första 5 ml blod i ett tomt rör och kassera förhindra att vävnadstromboplastin kommer in i provet.

Blanda försiktigt blodet omedelbart efter uppsamling utan att skumma med antikoagulantia (vänd på röret 3-4 gånger).

Efter provtagning av biologiskt material, kontrollera blodprovet. En noggrann kontroll av blodprover undviker följande fel: felaktigt förhållande mellan blod/citratvolymer; delvis levrat blod.

Blodet levereras till laboratoriet inom 45 minuter efter insamlingen. Under transport får blodet inte skakas. Blodprover bör inte transporteras vid temperaturer under 4°C och över 30°C.

Paramediciner-laboratorieassistent (medicintekniker) utför:

inmatningskontroll av levererat blod, inklusive: 1) kontrollera att remissformuläret är korrekt ifyllt. 2) kontrollera att den levererade blodvolymen är tillräcklig enligt etiketten på röret, 3) kontrollera provet för frånvaro av blodproppar när röret långsamt lutas.

centrifugering av det tillförda blodet för att erhålla:

blodplättsrik plasma ( centrifugeringsparametrar: rpm = 1000 rpm (ca 150-200g), centrifugeringstid 5-7 minuter.

För att välja de optimala centrifugeringsförhållandena styrs de av centrifugalkraften (g). Du kan använda formeln:

g = 1,118 x 0,00001r x n2,

där r är centrifugens radie - avståndet i centimeter mellan rotorns axel och mitten av provröret i centrifugsätet; n är antalet varv per minut.

blodplättsfattig plasma centrifugeringsparametrar: rpm = ~2500-3000 rpm (ca 1500-2000g), centrifugeringstid 10-20 minuter. För fullständigt avlägsnande av blodplättar utförs upprepad centrifugering, centrifugeringsparametrarna förblir desamma.

3. Efter centrifugering, kontrollerar plasmat för färg och genomskinlighet: ett hemolyserat prov, ikterisk eller lipemisk (kylös) plasma är inte föremål för undersökning.

Efter centrifugering avlägsnas supernatanten.

Önskvärd studera hemostasparametrar under 2 timmar efter blodprovstagning, men tillåten studie av koagulologiska parametrar i inom 4 timmar om plasman har separerats från sedimentet av erytrocyter och leukocyter.

Om nödvändigt långtidsförvaring"färska" prover (senast 2 timmar efter blodprovstagning) blodplättsfri plasma kan vara en gång att frysa och förvara upp till 2 veckor vid -20°C eller upp till 6 månader vid -70°C. Plasma bör tinas snabbt i varmt vatten (+36°C), blandas noggrant och undersökas omedelbart. Efter frysning är en förändring av APTT möjlig.

Metod för beredning av mikropreparat för hematologiska studier, metoder för fixering och färgning.

Metod för att förbereda blodutstryk för hematologiska studier.

Beredning och bearbetning av glas. Nya rena glas kan användas efter avfettning i en blandning av Nikiforov (lika delar av 96% etylalkohol och eter). Använda glas blötläggs i en dag i en varm tvållösning eller en lösning av tvättpulver (1 matsked pulver per 5 liter vatten). En dag senare dräneras lösningen, glaset tvättas med rinnande vatten. Sedan hälls de igen med en varm tvållösning eller en lösning av tvättpulver och kokas upp, kokas i samma lösning i 5-10 minuter (inte mer, för att undvika grumling av glasen). Efter kylning av lösningen dräneras den igen, objektglasen sköljs med rinnande vatten och varje objektglas tvättas med en borste under rinnande vatten. De på detta sätt behandlade glasen läggs ut på ett rent ark för att torka. Rena glas för avfettning placeras i en blandning av Nikiforov eller 96% etylalkohol i 60 minuter, torkas sedan torrt och förvaras i en ren behållare med bred hals. Rena glasögon rekommenderas att tas antingen med pincett eller för händer vid sidokanterna.

Förberedelse av utstryk. En liten droppe blod appliceras på en torr förberedd glasskiva närmare kortsidan med en glasstav (eller direkt från fingerpricken). Lämna glaset i horisontellt läge och smeta blodet på glaset med ett torrt, rent, slipat glas, håll det i en vinkel på 45°. Med en kort kant, efter att ha väntat tills allt blod har spridit sig över den, dras de snabbt över en glasskiva. Starkt tryck på glasskivan bör inte vara, eftersom detta kan skada blodkropparna. Utstrykarna lufttorkas och märks (gärna med en enkel penna). Det torkade smeten ska vara jämnt tunt, gulaktig i färgen, av tillräcklig storlek, placerad på ett avstånd av 1,0-1,5 cm från glasets kanter, uppta nästan hela glasets längd och sluta med en "panikel". Tjocka (djupt rosa) utstryk bör inte användas, eftersom cellmorfologin är svår att urskilja i dem.

Utstryk av standardkvalitet erhålls med hjälp av automatiska enheter utformade för beredning av utstryk och tillverkade av olika företag.

Fixering och färgning av blodutstryk. Före färgning fixeras blodutstryk vanligtvis i 5–10 minuter i metylalkohol för att förhindra hemolys, vilket kan uppstå vid kontakt med vatten under färgningsprocessen med ett vattenlösligt färgämne eller vid efterföljande kontakt med vatten. Fixeringstekniker beskrivs nedan tillsammans med färgningstekniker. Fixering krävs inte för Wright- och Leishman-fläckar, eftersom dessa fläckar innehåller metylalkohol.

Torra svabbar kan förvaras i 2 dagar på en torr, varm plats; i en varm, fuktig atmosfär utan fixering lagras de mycket mindre.

Blodkroppar innehåller basofila och acidofila strukturer som skiljer sig i reaktion (pH). Kärnorna är basofila och färgas blå. Mycket basofila (sura) basofila granulat är också blå. Hemoglobin (som är basiskt) färgas acidofilt, dvs rött. Färgning med en kombination av sura och basiska färgämnen kallas Romanovsky-färgning och har olika modifieringar (Pappenheim, Wright, Noht, Leishman, Giemsa, Jayner, etc.). Metylenblått används vanligtvis som huvudfärgämne, men toluidinblått används också. Som surt färgämne används eosin, azur I och azur II.

Kriterier för bra färgning: rosa färg på erytrocyter, lila färgning av granularitet hos neutrofiler på en rosa bakgrund, mild azurofil granularitet hos monocyter.

För att späda ut färgen är det bäst att använda neutralt färskt destillerat vatten. Inaktuellt destillerat vatten blir surt på grund av infångningen av koldioxid från atmosfären. Om destillerat vatten är alkaliskt får röda blodkroppar en smutsig blågrön färg; den del av leukocyterna som ska färgas blå blir lila, de eosinofila granulerna blir blåaktiga och grönaktiga istället för rosa och de neutrofila granulerna behålls. I surt vatten blir erytrocyter ljusorange, och leukocytkärnor är mycket bleka. Idealet är destillerat vatten med ett pH på 7,0, som buffras för att bevara det. Du kan använda färdiga bufferttabletter som är lösta i destillerat vatten.

För färgning av benmärgsutstryk är en pH 7,4-7,5 färg idealisk.

Färgningsmetoderna enligt Noht och Pappenheim accepteras som enhetliga.

Reagenser för fixering: 1) metylalkohol eller 2) May-Grunwald eosin-metylenblått lösning.

Reagens för färgning av utstryk enligt Nokht: 1) basisk lösning av azur I: 1 g färg löses i 1 liter destillerat vatten, lämnas i en mörk glasskål i 12-14 dagar vid rumstemperatur, varefter den används; 2) baslösning av kaliumeosin: 1 g färg löses i 1 liter destillerat vatten, lämnas i en mörk glasbehållare i 12-14 dagar vid rumstemperatur, varefter den används; 3) fosfatbuffert (Weise-blandning), pH 7,4-7,5: blanda 0,49 g kaliumdivätefosfat (KH2PO4) och 0,909 g natriumvätefosfat (Na2HPO4) och lös upp i 1 liter destillerat vatten; 4) arbetslösning av azure-eosin: före användning, blanda 25 ml av stamlösningen av azure II, 20 ml av stamlösningen av kaliumeosin och 55 ml av buffertlösningen (proportionerna av färgämnen kan variera, de är fastställda empiriskt vid beredning av färska partier av stamlösningar).

Reagens för färgning av utstryk enligt Pappenheim: 1) en lösning av eosin-metylenblått enligt May-Grunwald. I avsaknad av en färdig färglösning framställs den genom att lösa 1 g torr färg i 1 liter metylalkohol; 2) arbetslösning av azur-eosin enligt Nokht.

Fixering av utstryk. Fixeringslösningen hälls i en kyvett eller i ett fat med bred mun med en mald propp. Utstryk placeras i en behållare som sänks ned i en kyvett eller placeras en efter en i en skål i 5–10 minuter. Behållaren med glasen avlägsnas från fixeringslösningen (eller så tas glasen ut med pincett och placeras i ett stativ) och lämnas i luften tills de är helt torra.

Färgning enligt Nocht. Torkade fasta utstryk, utan att avlägsnas från behållaren, placeras i en kyvett med en fungerande färglösning under en strikt definierad tid (20-45 minuter), som väljs empiriskt för varje färgsats. I avsaknad av en kyvett med en behållare placeras glaset horisontellt på två glasstavar ("skenor") placerade parallellt med slaget uppåt och 3–4 ml av den fungerande färglösningen hälls på dem. Behållaren med glas tas ut ur kyvetten med färg och placeras i en kyvett med kranvatten (i avsaknad av behållare tvättas färgen av glasen med vatten utan att ta bort dem från glasstavarna). Utstrykarna lufttorkas.

Pappenheim färgläggning. Torra icke-fixerade blodutstryk placeras i en behållare och sänks ner i en kyvett med May-Grunwald-lösning i 3-5 minuter (eller 3-4 ml färg hälls på ett icke-fixerat utstryk med en pipett). Behållaren med utstryk sköljs i en kyvett med destillerat vatten och placeras sedan i en kyvett med azur-eosinfärg enligt Nokht i 8-15 minuter. Destillerat vatten läggs till objektglasen som placeras på "skenorna", utan att tömma färgen, i 1 minut, och sedan hälls färgen på smeten i 8-15 minuter, sedan tvättas färgen av med vatten. Utstrykarna lufttorkas.

Färgning enligt Romanovsky-Giemsa. Tillverkad på samma sätt som enligt Nokht. Som färgämne används en färdig Romanovsky-Giemsa-lösning, som späds före användning med en hastighet av 1 droppe färgämne per 1 ml destillerat vatten. Färgningstiden ställs in empiriskt för varje sats färgämne (25–40 min).

Wright färgläggning. Reagenser. 0,2 g Wrights färg (torrt pulver, BDH/E. Merck) löses i 100 ml metanol och får stå i flera dagar. Om erytrocyterna inte är tillräckligt tydligt färgade, förbered en 0,25 % eller 0,3 % lösning.

Färgframsteg. Några (cirka 8) droppar färg appliceras på smeten, får stå i 2-3 minuter (se till att färgen inte torkar ut), sedan hälls lika mycket buffrat vatten på smeten. Om färgen har mognat uppstår ett skum eller en film med metallglans på ytan av den utspädda färgen. Den utspädda färgen lämnas på smeten i 2-3 minuter och tvättas sedan av med en buffertlösning eller vatten. Färgen får inte sätta sig på ytan av smeten. Om detta händer, fylls utsmetningen med outspädd färg i 15-20 sekunder och sedan igen med en buffertlösning eller vatten.

Framställning av fosfatbuffert.

Lösning A (0,2 M KH2PO4): Lös 27,2 g salt i 1 liter destillerat vatten.

Lösning B (0,2 M Na2HPO4): Lös 35,6 g Na2HPO4 × 2H20 i 1 liter destillerat vatten.

För att få 100 ml av en buffertlösning med önskat pH, bör lösningarna A och B dräneras i de mängder som anges i tabellen. pH-värdet kontrolleras med en pH-mätare.

Beredning av fosfatbuffertlösning

Lösning, ml	PH värde

Leishman färgläggning. Reagenser. 0,15 g av Leishmans torrfärg löses i 133 ml absolut metylalkohol. Färgen ska helt lösas upp, det är lämpligt att mala färgkristallerna i en mortel i förväg. Förvara färgen i en flaska med glaspropp, filtrera inte.

Färgframsteg. Utförs på samma sätt som Wright-färgningen, men med dubbel utspädning av buffertlösningen. Några droppar färg (cirka 8) hälls på ett utstryk, hålls i 2 minuter. Tillsätt dubbel mängd buffertlösning (16 droppar), rör om genom att skaka och låt stå i 7-10 minuter. Färgen tvättas av med destillerat vatten på 2-3 sekunder. Vid längre tvätt försämras färgen. Utstrykarna torkas i ett galler i luften.

Förbereder en tjock droppe blod. Tre droppar blod som appliceras på ett objektglas på ett visst avstånd från varandra expanderas med vinkeln på ett rent objektglas till en storlek på cirka 1 cm i diameter, markeras med en penna och torkas sedan i luft i 1–2 timmar.

Färga en tjock droppe blod. Tjocka bloddroppar fixeras inte. Glasskivor med vältorkade tjocka droppar placeras på "skenorna" på något avstånd från varandra, och arbetslösningen av azur-eosin enligt Nokht hälls på dem i 8-10 minuter. Det sker en "utlakning" av erytrocyter. Därefter dräneras färgen och en ny del av arbetslösningen av azur-eosin enligt Nokht hälls på preparaten i 30-35 minuter. Objektglasen sköljs sedan försiktigt med destillerat vatten och torkas.

Automatisk färgning av utstryk

Eftersom en av de mest efterfrågade funktionerna i hematologilaboratoriet är beredning och färgning av blodutstryk, är försök att automatisera dem naturliga.

Det första automatiska systemet för förberedelse av utstryk utvecklades av Sysmex (Japan) redan 1990, och mer än 1600 system är för närvarande installerade över hela världen. Den stora erfarenheten som samlats under denna period användes i utvecklingen av en ny generationssystem - en helautomatisk SP-1000i utstryknings- och färgningsstation med en kapacitet på upp till 120 utstryk per timme. SP-1000i realiserar en hög grad av standardisering och kvalitet i utstryksberedning med den intelligenta kilmetoden, som gör att användaren kan justera mängden blodprov som appliceras, vinkeln på utstrykningsbladet, appliceringshastigheten och väntetiden, beroende på på testprovets hematokrit, med användning av från 8 upp till 16 olika regleringsnivåer. Blodprovtagning kan göras manuellt eller automatiskt från öppna eller slutna rör. Sysmex automatiserad utstryknings- och färgningsstation SP-1000i (Japan)

Systemet använder upp till sju flexibelt anpassningsbara färgningsprotokoll som gör att du kan standardisera kvaliteten på fläckfärgning och uppfylla de högsta kraven. Följande protokoll för dubbel- och enkelfärgning kan användas: enligt May-Grunwald-Giemsa, enligt Romanovsky och enligt Romanovsky-Giemsa. Blodutstryk färgas i ett dedikerat kassettsystem som endast innehåller ett objektglas per kassett. Med denna metod garanteras ett bra förhållande mellan blodutstryket och färgningsreagensen och det sker ingen avdunstning av metanol från reagenset till luften. För att säkerställa god blodfixering före färgning, är ett separat steg för förfixering av metanol integrerat i färgningsprocessen.

På grund av färgningsprotokollets flexibilitet kan ett specifikt protokoll för benmärgsfärgning användas.

Metod för att förbereda benmärgsutstryk för hematologiska studier.

Benmärgsundersökning - Myelogram Den första frågan som en benmärgsundersökning måste besvara är den kvantitativa aspekten av cellerna. Det är välkänt att i förhållande till perifert blod kan ett antal numeriska värden för antalet och procenten av olika typer av celler bestämmas, eftersom de är i ett fritt tillstånd och är relativt jämnt fördelade i suspensionen av vaskulärt blod . En helt annan sak kan sägas om benmärgen: sammansättningen av den hematopoetiska vävnaden är mycket heterogen och fördelningen av benmärgsceller är inte densamma. Således fluktuerar det direkta antalet myelokaryocyter i kammaren över ett mycket brett intervall, både i normalt tillstånd och inom ramen för samma sjukdom. De värden som vi avslöjade för personer varierade normalt från 27 000 till 112 000 kärnämnen per mm3 (Ursya). Litteraturdata fluktuerar ännu mer, med gränser på 12 000 och 300 000 per mm3 (Cartwright, Page). Efter centrifugering återfinns följande 4 skikt i hematokritröret: 1) övre fettgult skikt; 2) plasma; 3) ett gråvitaktigt skikt bildat av kärnceller; 4) ett rött lager bestående av erytrocyter. Mätningen av det gråvitaktiga lagret av kärnceller (myelocrit) är av begränsat värde eller till och med missvisande, eftersom de värden som finns hos normala individer också visar betydande fluktuationer. Dessutom finns kärnceller inte bara i detta lager, utan också i fett- och erytrocytlagren. Men utstryk av benmärgskoncentrat kan framställas från det grå-vitaktiga lagret efter avlägsnande av supernatantplasman. De har visat sig användbara i den diagnostiska processen i fall där direkta utstryk är dåliga i celler. Med tanke på att myelokaryocytkammare och myelokritbestämningar endast ger ungefärliga resultat med begränsad reproducerbarhet, är dessa kvantifieringsmetoder inte tillfredsställande. Materialet som extraheras vid sugpunktion är ett prov av benmärg blandat med blod i olika proportioner. Graden av utspädning av benmärgen med blod beror på ett antal faktorer. 32P-märkning har visat att spädningen av aspirerad benmärg med blod varierar från 40 % till 100 %. Det bör dock noteras att studiet av benmärgen för att ställa en diagnos baseras primärt på en kvalitativ studie av det cellulära innehållet, och endast sekundärt på de kvantitativa värdena av detta innehåll. Det är därför som kvantitativa metoder för att bestämma benmärgsceller består av en semikvantitativ bedömning av benmärgens cellulära sammansättning, jämfört med normala prover, på: a) utstryk med krossade klumpar; b) histologiska snitt. Studien av utstryket utförs huvudsakligen med en torr lins, på flera utstryk, med följande mål: a) semikvantitativ bedömning av benmärgscellmassa; b) bestämning av närvaron och densiteten av megakaryocyter; c) detektion av jätteceller eller bon av onormala celler; d) identifiering av de mest lämpade områdena för forskning genom nedsänkning. På utstryk erhållna genom att krossa benmärgspartiklar, särskiljs följande tre koncentriska zoner: a) centrala; b) extern; c) mellanliggande. Den centrala zonen bildas av fettvakuoler, stromaceller, granulocyter och många förstörda celler. Den yttre zonen innehåller en stor mängd blod, vilket späder ut benmärgscellerna. Liksom tunna utstryk bidrar det bara till studiet av de morfologiska detaljerna hos myeloidceller och erytrocyter. Den mest täta cellmassan ligger i mellanzonen, vilket möjliggör en optimal studie som kan klargöra alla frågor som har beskrivits. Här är märgcellerna välbevarade och ordnade i holmar eller bon, precis som man ser i märgen. Medan benmärgstopografin bibehålls, är resultaten av studien av denna zon mer homogena och motsvarar det faktiska tillståndet hos benmärgen, vilket bekräftas genom jämförelse med dess histologiska bilder. Semi-kvantitativ bestämning av celldensitet uttrycks som: a) normal, b) rik eller c) mager jämfört med normal benmärg. Identifiering av en normal eller riklig cellmassa är ett värdefullt fynd, medan knapp benmärg bör övervägas med försiktighet. För att bevisa förekomsten av faktisk hypoplasi bör flera plattor undersökas, en punktering i flera benområden och/eller en benbiopsi bör göras. Den mest exakta informationen om benmärgscellmassan erhålls genom att undersöka histologiska snitt. Hos en vuxen är förhållandet mellan fett och aktivt cellparenkym normalt 1:1 eller 2:1. Vissa författare anser att benmärgen är hypocellulär när hematopoetiska celler upptar mindre än en fjärdedel av benmärgsklumparna. En kvalitativ benmärgsundersökning är avgörande för att ställa en diagnos. Det utförs, genom nedsänkning, både på tunna utstryk och i synnerhet på utstryk med krossade klumpar från den mellanliggande zonen. Valet av de bästa korrekt sträckta och färgade utstrykarna med tydligt definierade och morfologiskt välbevarade celler rekommenderas. Denna studie beskriver: a) identifiering av olika typer av myeloidceller; b) bestämning av mognadsgraden för varje cellrad; c) klargörande av förhållandet mellan granulocyter och erytroblaster (G/E), d) identifiering av celler i mitosfasen; e) beskrivning av de atypiska celler som påträffats. Efter att ha undersökt flera utstryk sammanställs antingen ett detaljerat beskrivande "myelogram" (som innehåller slutsatserna som gjorts efter att ha dechiffrerat utstrykarna), eller ett myelogram i procent, fastställt av minst 300-500 element. Det finns två sätt att sammanställa ett procentuellt myelogram: 1) tilldela de återstående cellraderna till 100 granulocyter; 2) procentuell visning av varje typ av celler från det totala antalet benmärgsceller. Ur en statistisk synvinkel verkar den senare metoden vara mer korrekt och återspeglar tydligen den verkliga bilden av benmärgens cellulära sammansättning. Formlerna som fastställts av enskilda författare skiljer sig avsevärt, eftersom det är svårt att bestämma de verkliga medelvärdena i en sådan heterogen vävnad som benmärgen. Tabellen visar, enligt Wintrobe, resultaten av studien av utvalda benmärgsprover från 12 normala individer. Normalt myelogram

Myelogramparametrar Medelvärde (%) Variationsområde (%)

Retikulära celler 0,9 0,1-1,6 Odifferentierade blaster 0,6 0,1-1,1 Myeloblaster 1,0 0,2-1,7

Promyelocyter 2,5 1,0-4,1

Myelocyter neutrofiler 9,6 7,0-12,2 Metamyelocyter neutrofiler 11,5 8,0-15,0 Stab neutrofiler 18,2 12,8-23,7 Segmenterade neutrofiler 18,6 13,1-24,1 Totalt antal neutrofila celler 60,8 52,7-68,9 Eosinofila myelocyter 0,1 0,0-0,2 Eosinofila metamyelocyter 0,2 0,1-0,4 Eosinofiler 2,8 0,4-5,2

Totalt antal celler av den eosinofila serien 3,2 0,5-5,8 Basofila myelocyter 0,1 0-0,3

Basofiler 0,1 0-0,3

Totalt antal celler i den basofila serien 0,2 0-0,5 Lymfoblaster 0,1 0-0,2

Prolymfocyter 0,1 0-0,2

Lymfocyter 8,8 4,3-13,3

Totalt antal lymfoida celler 9,0 4,3-13,7 Monoblaster 0,1 0-0,2

Monocyter 1,9 0,7-3,1

Plasmablaster 0,1 0-0,2

Proplasmocyter 0,1 0,1-0,2

Plasmaceller 0,9 0,1-1,8

Erytroblaster 0,6 0,2-1,1

Basofila normoblaster 3,6 1,4-5,8 Polykromatofila normoblaster 12,9 8,9-16,9 Oxyfila normoblaster 3,2 0,8-5,6

Totalt antal erytroida celler 20,5 14,5-26,5 Megakaryocyter 0,4 0,2-0,6

Enligt våra studier på friska människor är resultaten följande:

ett antal granulocyter 56-70%,

erytroblastisk serie 23-30 %, lymfoplasmacytisk serie 5-10 %, monocytmakrofagerserie 1-2 % och megakaryocytserie 0,1-0,8 % (Ursya). En förändring i andelen normala myeloidrader eller deras ersättning med onormala celler tyder ofta på typen av sjukdom. Retikulära celler uppträder mer sällan och dessutom i litet antal. Helt av en slump visar utstryk (eller benmärgsavtryck) osteoblaster och/eller osteoklaster, vilket inte bör förväxlas med neoplastiska celler. Deras närvaro observeras oftare hos barn, mindre ofta hos vuxna med primär myelofibros eller sekundärt, efter karcinomatös metastasering, med akut leukemi, osteoporos etc. G/E-förhållandet erhålls genom att dividera granulocyter med antalet erytroblaster. Hos en normal vuxen är detta förhållande i genomsnitt 3/1 eller 4/1, med gränser som uppskattas till 2/1 (när endast omogna granulocyter ingår) och 5/1 (när det gäller alla granulocyter - mogna och omogna). H/E-förhållandet fluktuerar med åldern: vid födseln är det litet (1,8/1), vid 2 veckors ålder stiger det till 11/1, minskar sedan gradvis, och hos ettåriga barn når det värdena av en vuxen. H/E-förhållandet är normalt i fall av global benmärgshypo- eller hyperplasi, såväl som vid proliferation av enskilda celler som inte ingår i beräkningen av detta förhållande, till exempel vid plasmacytom. Vid leukemier, leukomliknande reaktioner och erytroblastopenier är förhållandet högt, medan det vid anemier med erytroblastisk hyperplasi är lågt eller omvänt (megaloblastiska, hemolytiska anemier). Före utfärdandet av myelogramdata som erhållits efter studien av utstryk är det nödvändigt att klargöra: a) punkteringsstället; b) bentäthet; c) de förhållanden under vilka sugningen ägde rum; d) den makroskopiska aspekten av det valda materialet. Benmärgsundersökning är en komplex process som bygger på integrationen av många och varierande data. Dess resultat bör återspegla allmänna slutsatser, mer baserade på slutsatser än på mekanisk registrering av enskilda figurer, som dessutom fluktuerar. Slutsatsen av ett myelogram bör klargöra antingen diagnosen eller indikationerna för ytterligare studier som härrör från studien av benmärgen. Vid blodsjukdomar hjälper sugpunktion till att klargöra diagnosen med hjälp av utstryk och sektioner med klumpar i 80% av fallen. I andra fall är benbiopsi och histologisk undersökning av benmärgen indikerade. Biooptiskt urval och histologisk undersökning verkar nödvändiga för: a) primär eller sekundär myelofibros; b) benmärgsaplasi eller hypoplasi; c) sjukdomar som uppstår med lesioner av granulomatös typ (t.ex. , Godgkins sjukdom, sarkoidos, tuberkulos, etc.); d) karcinomatös metastas; e) i alla fall när materialet som valts genom punktering är otillfredsställande eller aspekten av benmärgen inte är övertygande. Efter biooptisk provtagning förbereds avtryck för cytologisk undersökning, eftersom histologiska snitt ger lite information om de strukturella detaljerna hos hematopoetiska celler som är trånga, inte utspridda och inte standardiserade. Dessutom orsakar fixering cellretraktion och histologisk färgning är mindre selektiv än cytologisk färgning. Det är därför som en fullständig undersökning av benmärgen involverar både cytologisk - på utstryk eller avtryck, och histologisk - på avsnitt av studien. Man måste komma ihåg att cytologiska och histologiska metoder för benmärgsundersökning inte är uteslutna, utan tvärtom är komplementära: en biopsi är en kvantitativ och arkitektonisk metod, medan ett myelogram är en kvalitativ och cytologisk metod.

Metod för att räkna blodkroppar i Goryaev-kammaren.

Goryaevs kammare - en anordning utformad för att räkna antalet celler i en given volym vätska. Det används vanligtvis för att bestämma antalet bildade grundämnen i ett blodprov. Kamrarna består av en tjock glasskiva med tvärgående snitt applicerade på dem, som bildar tre tvärgående plana områden. Mellanplattformen är delad av en längsgående slits i två, som var och en har ett rutnät ingraverat på sig. På båda sidor av mittplattformen i Goryaev-kammaren finns två andra 0,1 mm högre (i Fuchs-Rosenthal-kammaren 0,2 mm) högre än den mellersta. Dessa platsers plan tjänar till att slipa täckglaset tills de så kallade Newtonska ringarna uppträder. Efter att ha gnuggat täckglaset skapas en kammare, stängd på två sidor, och på de andra två finns det luckor (kapillärutrymmen) genom vilka kammaren fylls. Rutnätsprincipen är densamma. De är indelade i ett eller annat antal rutor, grupperade på olika sätt. Ett konstant värde i alla rutnät är den så kallade "lilla kvadraten", vars sida är 1/20 mm, därför är dess yta 1/400 mm2. Med hjälp av Goryaev-kameran är det också möjligt att bestämma mikroskopets förstoring. Utåt är det en genomskinlig parallellepiped (glasskiva), med spår och ett mikroskopiskt galler applicerat. Dimensionerna för de små avdelningarna i rutnätscellen är 0,05 mm, och de stora avdelningarna är 0,2 mm. I det här fallet appliceras gallret på en plattform (sektion av glas) belägen 0,1 mm lägre än två intilliggande plattformar. Dessa områden används för att lappa täckglaset. Som ett resultat är volymen av vätska ovanför kvadraten som bildas av de stora divisionerna av Goryaev-nätet 0,004 mikroliter. Genom att räkna antalet celler över en stor kvadrat kan du beräkna densiteten för en given celltyp i suspension med hjälp av formeln: Antal celler/ml = antal celler ovanför den stora kvadraten * 2,5 10^5 Med Goryaev-kameran som en slags standard kan du bestämma mikroskopets förstoring med formeln: Kg=(m2-m1)/(a*N) var kgär förstoringen av mikroskopet; m 1 - positionen för den vänstra gränsen för cellen i Goryaev-kammaren; m 2 - positionen för den högra gränsen för en cell eller grupp av celler; N- antalet celler mellan de uppmätta gränserna; a- cellstorleken på Goryaev-kammaren (lika med 0,05 mm). Goryaev-kammaren används också för att räkna antalet celler i kulturen. Formeln för att räkna blodkroppar i Goryaev-kammaren är - x = (a 400 c) / b, där x är det önskade antalet formade element i 1 mm3; a - summan av formade element räknade i en viss volym av kammaren; b - antalet räknade små rutor; c - blodspädning.

Metod för att räkna oocystor i Goryaev-kammaren. Denna metod används vanligtvis när man experimentellt infekterar djur med en exakt bestämd mängd oocystor (en lämplig mängd milliliter suspension injiceras i djuret). 1 ml suspension innehållande oocystor placeras i Goryaev-kammaren. Eftersom Goryaev-kammarens volym är 0,9 m3, multipliceras antalet räknade oocystor med 1111. Det resulterande antalet är tillräckligt för antalet oocystor i 1 cm3 lösning. För en mer exakt bestämning bör beräkningarna utföras minst tre gånger, och sedan bör det aritmetiska medelvärdet härledas. Antalet oocystor som krävs för infektion mäts med en graderad pipett. För en jämnare fördelning av oocystor i inkubationsmediet måste innehållet i röret skakas upprepade gånger.

Antal erytrocyter i Goryaev-kammaren Princip. Den exakta mängden blod blandas jämnt i en viss mängd vätska och placeras i en kammare med en känd volym där blodsuspensionen är fördelad i ett enda lager. Botten av kammaren är grafisk, vilket gör det möjligt att noggrant räkna erytrocyter. Reagens: 0,9 % natriumkloridlösning. Specialutrustning: mikroskop, Goryaevs kamera, laboratorieprovrör eller en kapillär från Salys hemometer. Definition framsteg. Tillsätt 8 ml 0,9 % natriumkloridlösning och 0,02 ml blod till ett torrt, rent provrör. Pipettens spets torkas preliminärt, blodet blåses till botten av röret och pipetten tvättas noggrant med det övre lagret av vätskan. Blanda innehållet i röret väl. En blodspädning på 1:400 erhålls, dvs blodet späds 400 gånger. Med förtjockning av blodet är det lämpligt att späda det med 500, 600, 700, 800 gånger. Kammaren och täckglaset ska tvättas och torkas torrt. Täckglaset gnids mot kammaren så att iriserande ringar uppstår. Ta en droppe utspätt blod från provröret och fyll kammaren med den, applicera den på kanten av täckglaset. Erytrocyter räknas 1 min efter att kammaren fyllts under ett lågförstoringsmikroskop (x8 objektiv, x10 eller x15 okular) med ett täckt membran eller sänkt kondensor (i ett mörkt synfält) . Erytrocyter räknas i fem stora (eller 80 små) rutor arrangerade diagonalt. De erytrocyter som ligger inuti den lilla torget, liksom på dess vänstra och övre väggar, beaktas. Celler placerade på den högra och nedersta raden av kvadraten räknas inte. Beräkning: Det beräknade antalet celler i 80 små rutor multipliceras med 20 000 vid en blodspädning på 1: 400, med 25 000 vid en utspädning av 1: 500 eller med 30 000 vid en utspädning av 1: 600 och det slutliga resultatet erhålls i miljoner per 1 μl. I detta fall antas det att volymen av en liten kvadrat är 1/4000 μl. För att räkna celler i 1 liter multipliceras även antalet röda blodkroppar i 1 µl med 1 000 000. Notera. Det är inte tillåtet att studera blod med blodproppar; cellantal omedelbart efter fyllning av kammaren (utan att vänta 1 min); användningen av dåligt tvättade och torkade pipetter och provrör, reagenser av dålig kvalitet som orsakar hemolys. Med förbehåll för alla beräkningsregler kommer felet att vara i genomsnitt ± 2,5 %.

Desinfektionsregler Efter användning måste Goryaev-kameran desinficeras 3% lösning väteperoxid, skölj med destillerat vatten och torka med en mjuk trasa. Förvara kameran på en torr plats.

Arbetssätt med hematologiska analysatorer.

Analysator-hematologisk- en anordning (en uppsättning utrustning) utformad för kvantitativ forskning celler blod i kliniska diagnostiska laboratorier. Kan vara automatisk eller halvautomatisk. En halvautomatisk hematologisk analysator skiljer sig från en automatisk genom att processen att späda ett blodprov utförs av en separat enhet - en spädare. Efter beredning av helblodsspädningen måste operatören överföra det utspädda provet till mätmodulen. För närvarande tillverkas praktiskt taget inte halvautomatiska analysatorer.

Automatic Hematology Analyzer är ett helautomatiskt instrument där hela analysprocessen utförs automatiskt.

Moderna automatiska analysatorer kan bearbeta dussintals prover (från 60 till 120) per timme, med noggrannhet och reproducerbarhet enligt specifikation, såväl som att lagra testresultat i det inbyggda minnet och, om nödvändigt, skriva ut dem på det inbyggda termisk skrivare eller en extern skrivare.

Moderna hematologiska analysatorer klassificeras enligt nomenklaturen för de bestämda indikatorerna för blodkroppar.

Hematologianalysatorer med åtta parametrar bestämma följande parametrar: koncentration erytrocyter(RBC) leukocyter(WBC) blodplättar(plt) hemoglobin(Hb), såväl som följande erytrocytparametrar: genomsnittlig erytrocytvolym (MCV), genomsnittlig erytrocythemoglobinhalt (MCH), genomsnittlig (MCHC), hematokrit(Hct).

Hematologiska analysatorer med åtta parametrar tillverkas praktiskt taget inte för närvarande.

Hematologianalysatorer klass 3-diff. Hematologiska analysatorer av klass 3-dif, beroende på den producerade modellen, låter dig bestämma från 16 till 22 indikatorer för blodkroppar. Analysatorer av denna klass, utöver de parametrar som bestämmer åttaparameteranalysatorerna, bestämmer tre subpopulationer av leukocyter: koncentrationen av lymfocyter (Lm), granulocyter (Gr) och de så kallade genomsnittliga leukocyterna (Mid), samt deras procentandel Lm%, Gr% och Mid%. Därav namnet på klassen 3-dif. Dessutom bestämmer hematologiska analysatorer av denna klass variationskoefficienten för erytrocytvolymen (RDW) och ett antal indikatorer som kännetecknar blodplättar: den genomsnittliga trombocytvolymen (MPV), andelen av trombocytvolymen (Tct) (analog med hematokrit), variationskoefficient för trombocytvolym (PDW).

Viktig diagnostisk information, som kan erhållas av hematologiska analysatorer av denna klass, är fördelningsfunktionerna i volym av erytrocyter, leukocyter och blodplättar - histogram.

Hematologiska analysatorer klass 5-dif. Den största skillnaden mellan 5-dif-hematologianalysatorer och 3-dif-analysatorer är deras förmåga att detektera alla 5 subpopulationer av leukocyter: lymfocyter (Lym), monocyter (Mon), neutrofiler (Neu), basofiler (Bas) och eosinofiler (Eos), samt deras procentuella innehåll av Lym%, Mon%, Neu%, Bas% och Eos%. Impedansräkningsmetoden, även känd som Coulter disk, som används i 3-dif-analysatorer, kan inte skilja mellan neutrofiler, basofiler och eosinofiler, därför används en annan metod för celldifferentiering i 5-dif-analysatorer. Det bygger på principen diffraktion laserstrålning på leukocytceller och vidare analys av spridd strålning. "Genomsnittliga" leukocyter skiljer sig inte i storlek tillräckligt för att kunna särskiljas med impedansmetoden, men de har en annan inre struktur och interagerar annorlunda med färgämnen. Och metoden för att upptäcka ett diffraktionsmönster visar sig vara känslig för cellers inre struktur. Således räknas erytrocyter och blodplättar av en Coulter-räknare och leukocyter av en separat laserenhet.

Arbete 8. Kvantitativ bestämning av protein i blodserum

4. Sammansättning och egenskaper hos komplexa proteiner

Arbete 9. Hemproteinernas kemiska natur

Arbete 10. Identifiering av kolhydratkomponenten i glykoproteiner

Arbete 11. Kvalitativa reaktioner på fosfoproteiner

Arbete 12. Kvantitativ bestämning av innehållet av sialinsyror i blodserum med Hess-metoden

Arbete 13. Nukleoproteiners kemiska natur

Nukleinsyror

1. Studie av nukleinsyrors kemiska natur

Arbete 14. Kvalitativa reaktioner på nukleinsyrakomponenter

Kvantitativa metoder för bestämning av nukleinsyror

Arbete 15. Spektrofotometrisk metod för kvantitativ bestämning av nukleinsyror enligt A.S. Spirin

Arbete 16. Fotokolorimetriska metoder för kvantitativ bestämning av nukleinsyror

Arbete 17. Studie av fosfolipider

Arbete 18. Kvalitativa reaktioner på steroider

Enzymer

Jämförande verkan av enzymer och icke-biologiska katalysatorer

Arbete 19. Jämförelse av verkan av α-amylas av saliv och saltsyra på reaktionen av stärkelsehydrolys

2. Identifiering av enzymer tillhörande olika klasser

Arbete 20. Detektion av oxidoreduktaser i biologiskt material

Arbete 21. Detektion av kolinesteras

I blodserum enligt Herzfelds och Stumpfs uttryckliga metod

Arbete 22. Bestämning av aktiviteten av fruktos-1,6-bisfosfataldolas i blodserum enligt metoden enligt V.I. Tovarnitsky och E.N. Voluyskaya

Konstruktion av en kalibreringsgraf

Arbete 23. Bestämning av glukosfosfatisomeras

I blodserumet

3. Studera enzymers kinetiska egenskaper

Arbete 24. Kinetik för enzymatiska reaktioner på exemplet saliv α-amylas

4. Specificitet för enzymverkan

Arbete 25. Demonstration av absolut substratspecificitet

5. Enzymaktivitetsmodifierare

Arbete 27. Aktivatorer och hämmare av saliv α-amylas

muskelvävnad

Arbete 29. Icke-konkurrensmässig hämning av blodkatalas

6. Kvantifiering av enzymaktivitet

Arbete 30. Kvantitativ studie av aktiviteten av läkemedlet laktatdehydrogenas enligt Kornberg

Arbete 31. Fotokolorimetrisk metod för att studera aktiviteten av laktatdehydrogenas i blodserum enligt Sevel och Tovarek

Arbete 32. Bestämning av alkalisk fosfatasaktivitet i blodserum enligt Bodansky

7. Studie av isoenzymer

Arbete 33. Separation av laktatdehydrogenasisoenzymer av blodserum genom elektrofores i polyakrylamidgel enligt Dietz och Lubrano

Arbete 34. Bestämning av aktiviteten av y-glutamyltransferas i blodserum

Biokemi av matsmältningen

Arbete 35. Studie av magsaftens sura komponenter

Arbete 36. Bestämning av surheten i magsaft med diagnostiksatsen "Acidotest"

Arbete 37. Proteinhydrolys av enzymer i matsmältningskanalen

Arbete 38. Studie av dynamiken för hydrolys av triacylglyceroler under verkan av pankreaslipas

Energiutbyte (bioenergi)

1. Studie av biologiska oxidationsprocesser i djurvävnader Arbete 39. Detektion av cytokromoxidas i muskelvävnad

Arbete 40. Demonstration av processen för oxidativ fosforylering och verkan av frånkopplare på den

Arbete 41. Detektion av glykolys i muskelvävnad

Arbete 42. Analys av adeninnukleotider genom jonbytartunnskiktskromatografi

Arbete 43. Bestämning av kreatinfosfokinasaktivitet i blodserum enligt Ennor och Rosenberg

Analys av pigment och oxidativa processer hos fotosyntetiska organismer

Arbete 44. Kvalitativa reaktioner på växtpigment

Arbete 45. Bestämning av peroxidasaktivitet i växtmaterial enligt metoden enligt A.N. Boyarkin

Kolhydratmetabolism

Arbete 46. Bestämning av glukos i blodet

Arbete 47. Kvantitativ bestämning av glukos i blodet med glukosoxidasmetoden

Arbete 48. Bestämning av halten mjölksyra i blodet enligt Barker och Summerson

Arbete 49. Bestämning av halten av pyrodruvsyra i blodet enligt Friedemann och Haugen

lipidmetabolism

Jobba 50

Arbete 51

Arbete 52. Bestämning av kolesterol i blodserum enligt metoden för Ilk

Arbete 53. Bestämning av innehållet av totala fosfolipider i blodserum

Arbete 54. Separation av blodserumlipider genom tunnskiktskromatografi

Metabolism av proteiner och aminosyror

Arbete 55. Bestämning av innehållet av proteinfraktioner av blodserum med turbidimetrisk metod

Arbete 56. Bestämning av aktiviteten av katepsiner i blodserum enligt A.A. Pokrovsky, A.I. Archakov och O.N.

Cathepsins

Arbete 57. Bestämning av aktiviteten av aspartat och alaninaminotransferas i blodserum enligt Reitman och Frenkel

Arbete 58. Bestämning av histidasaktivitet i blodserum enligt Tabor och Mehler, modifierad av V.A.

Arbete 59. Bestämning av innehållet av fritt hydroxiprolin i urinen enligt Neumann och Logan, modifierad av sid.

Metabolism av kväveinnehållande icke-proteinämnen

1. Studie av vanliga produkter av kvävemetabolism

Arbete 60. Kvantitativ bestämning av kvarvarande kväve i blodet med fotokolorimetrisk metod

Arbete 61. Kvantitativ bestämning av urea i blodserum och urin

Arbete 62. Kvantitativ bestämning av kreatin och kreatinin med Browns metod

2. Studie av utbyte av nukleinsyror och nukleotider

Arbete 63. Bestämning av aktiviteten av surt deoxiribonukleas (dnCase) i blodserum enligt A.A.

Arbete 64. Bestämning av halten urinsyra i blodserum enligt Muller och Seiferts metod

3. Studie av porfyrin (pigment) metabolism

Arbete 65. Bestämning av bilirubin och dess fraktioner i blodserum enligt Yendrashik, Cleghorn och Grof

Molekylär patologi

1. Uttrycka diagnostik av aminosyrametabolismens patologi Arbete 66. Detektion av hyperaminoaciduri

Arbete 67. Uttrycka metoder för att diagnostisera fenylketonuri

Arbete 68. Diagnos av tyrosinos Millon test för tyrosin

Arbete 69. Detektion av alkaptonuri genom ett test för homogentisinsyra

Jobba 70

2. Uttrycka diagnostik av patologier av kolhydratmetabolism Arbete 71. Detektion av pentosuri genom Bial-test

Arbete 72. Detektering av fruktosuri genom Selivanovs test

Arbete 73. Detektion av mukopolysackaridoser genom ett test med toluidinblått för mukopolysackarider

Arbete 74. Bestämning av innehållet av porfobilinogen i urin

Arbete 75. Kvantitativ bestämning av halten delta-aminolevulinsyra i urin

Arbete 76

Metaboliska regulatorer

1. Studie av vitaminer Arbete 77. Kvalitativa reaktioner på vitaminer

Arbete 78. Bestämning av innehållet av tiamin och riboflavin med fluorimetrisk metod i multivitaminpreparat

Arbete 79. Kvantitativ bestämning av askorbinsyra i medicinalväxter

2. Studier av hormoner, mediatorer och deras metaboliter

Arbete 80. Kvalitativa reaktioner på protein-peptidhormoner.

Arbete 81. Kvalitativa reaktioner på hormoner - derivat av aminosyror

Arbete 82. Kvalitativa reaktioner på steroidhormoner och deras metaboliter

Arbete 83. Reglering av insulin- och adrenalinnivåer av glukos i blodet hos djur

Arbete 84. Kvantitativ bestämning av histamin i blod med diazotiserat n-nitroanilin enligt N.V. Klimkina och S.I. Plitman

Studie av biologiska vätskor

1. Biokemiska blodprov Arbete 85. Bestämning av hemoglobinhalten i blodet genom dess ljusabsorption

Arbete 86. Bestämning av halten av fosterhemoglobin i humana erytrocyter

Arbete 87. Bestämning av innehållet av glykosylerat hemoglobin i erytrocyter med fotokolorimetrisk metod

Arbete 88. Bestämning av koncentrationen av haptoglobiner i blodserum med fotokolorimetrisk metod

Arbete 89

Arbete 90. Bestämning av α-amylasaktivitet i blodserum med amyloklastisk metod

Arbete 91. Bestämning av kalciumhalt i blodserum med murexidmetoden

Arbete 92. Tymoltest enligt Huergo och Popper

Arbete 93. Sublimat-sedimentär reaktion

Arbete 94. Kvantitativ bestämning av järnhalt i blodserum

2. Biokemisk studie av urin

Arbete 95. Studie av urinens fysikalisk-kemiska egenskaper

Arbete 96. Bestämning av ketonkroppar och glukos i urin

Arbete 97. Bestämning av protein i urin med Brandenberg-Roberts-Stolnikov-metoden

Arbete 98. Kvalitativ bestämning av indican i urin

Arbete 99. Detektering av vissa pigment i urin.

Metabolism av xenobiotika

Studie av processerna för oxidation och konjugering av xenobiotika. Arbete 100. Avslöja mikrosomers andningsaktivitet

Arbete 101. Studie av oxidativ n-demetylering i levermikrosomer enligt Our

Arbete 102. Bestämning av hydroxylasaktivitet hos levermikrosomer enligt Kato och Gilet

Jobb 103

Arbete 104. Bestämning av alkoholdehydrogenasaktivitet i blodserum enligt Shkursky et al.

Jobba 105

Arbete 106. Detektion av acetylering (inaktivering) av isonicotinsyrahydrazid (gink) i kroppen

Studie av lipidperoxidation av biologiska membran

Arbete 107. Bestämning av erytrocyternas känslighet för peroxidhemolys

Arbete 108. Bestämning av lipidperoxidationshastigheten i biomembran

Ansökan

2.Biokemiska indikatorer för blodplasma

1. Allmänna kliniska normer

2. Särskild undersökning av urin

Magsyra

2. Fosfatbuffert (0,1 m, pH 5,8-8,0)

3. Tris-buffert (0,1 m, pH 7,1-9,2)

4. Acetatbuffert (0,2 m, pH 3,6-5,8)

5. Glycinbuffert (0,05 m, pH 8,6-10,6)

3. Beredning av några reagenser

Innehållsförteckning

2. Fosfatbuffert (0,1 m, pH 5,8-8,0)

Na2HPO4 0,2 M, ml	Na2H2PO4 0,2 M, ml

3. Tris-buffert (0,1 m, pH 7,1-9,2)

24,2 g tris-(hydroximetyl)aminometan löses i en 1 liters mätkolv (i 500 ml H2O). För att erhålla det erforderliga pH-värdet tillsätts volymen 1 M HCl som anges i tabellen och volymen justeras till 1000 ml med destillerat vatten.

4. Acetatbuffert (0,2 m, pH 3,6-5,8)

Natriumacetat 0,2 M, ml	Ättiksyra 0,2 M, ml		Natriumacetat 0,2 M, ml	Ättiksyra 0,2 M, ml

5. Glycinbuffert (0,05 m, pH 8,6-10,6)

De angivna volymerna glycin och natriumhydroxid blandas och volymen justeras med destillerat vatten till 200 ml.

	Glycin 0,2 M, ml	NaOH 0,2 M, ml		Glycin 0,2 M, ml	NaOH 0,2 M, ml

3. Beredning av några reagenser

Aktiverande lösning. 155 mg reducerat glutation och 400 mg kristallint albumin placeras i en mätkolv med en kapacitet på 100 ml, de löses i 50 ml destillerat vatten och pH justeras till 8,2 med användning av 1 M NaOH-lösning. Tillsätt sedan vatten till märket.

Ammoniaklösning av silvernitrat. En koncentrerad lösning av ammoniak tillsätts till en 2-3% lösning av silver tills fällningen löser sig.

Acetatbuffert pH 3,6. Bered genom att blanda 463 ml av lösning A och 37 ml av lösning B, späd till märket med vatten i en mätkolv till 1 liter. Lösning A: Späd 11,55 ml isättika med vatten i en 1 liters mätkolv. Lösning B: Lös 27,2 g natriumacetat i vatten i en 1 liters kolv.

Biuret reagens (Benedicts reagens). 173 g natriumcitrat och 100 g natriumkarbonat löses i 300 ml destillerat vatten i ett vattenbad. Separat löses 17,3 g kopparsulfat i 300 ml vatten. Båda lösningarna dräneras och den totala volymen bringas till 1 liter.

buffert-lösning. 2,76 g Veronal och 2,06 g Medinal löses i 1 liter destillerat vatten. Förvaras i kylskåp, om en fällning uppstår är lösningen inte lämplig att använda.

suspension av kol. 0,25 g aktivt kol placeras i en 100 ml mätkolv och späds med acetatbuffert pH 3,6. Skaka väl innan användning.

Reducerande reagens. 1% lösning av askorbinsyra framställd med 0,016% kopparsulfatlösning.

Hemoglobin, 4% lösning i acetatbuffert (pH 4,0). Först bereds en 8% hemoglobinlösning i en 8 mol/l urealösning, hålls i 2 timmar i en termostat vid 60°C och späds 2 gånger med acetatbuffert före användning.

Glycyl-glycin. 0,55 mmol/l, pH 8,3. 3,63 g glycylglycin placeras i en 50 ml mätkolv, fylld med vatten till märket (buffertlösning).

Denaturerande lösning

Diazoreagens för bestämning av bilirubin. Förbered två lösningar. Första lösningen: 3 g sulfanilsyra löses i 500 ml destillerat vatten, 15 ml koncentrerad saltsyra tillsätts (i ett varmt bad), volymen justeras till 1 liter med vatten. Andra lösningen: 0,5 % vattenhaltig natriumnitritlösning. Före användning, blanda 5 ml av den första lösningen och 0,25 ml av den andra.

Diacetyl, arbetslösning. 1 ml diacetyl späds med destillerat vatten i en 100 ml mätkolv (lösningen förvaras i kylskåp). Arbetslösningen av diacetyl framställs före användning genom att tillsätta 24 ml destillerat vatten till 1 ml av stamlösningen av diacetyl.

Difenylaminreagens. 1 g difenylamin löses i 100 ml isättika. Till lösningen sätts 2,75 ml koncentrerad svavelsyra.

Kalibreringslösning. Basisk - 0,75 mmol/l ALA (100 µg/ml) uttryckt som bas: 0,00635 g ALA-hydroklorid löses i acetatbuffert pH 3,6 i en 50 ml mätkolv. Förvara i kylen i högst en månad. En fungerande kalibreringslösning framställs av huvudlösningen, 1 μg / ml. Förbered före användning genom att späda stamlösningen med acetatbuffert 100 gånger.

Kalibreringslösning. 22,5 mg dihydroxiaceton löses i 25 ml vatten under upphettning. 1 ml av denna lösning innehåller 10 μmol dihydroxiaceton. En kalibreringslösning av dihydroxiaceton hälls i ett antal provrör (se arbete), fylls på till erforderlig volym, och sedan utförs reaktionen på samma sätt som vid bestämning av enzymets aktivitet.

Kalibrering (standard) lösning av järn (30 µmol/l).

Morasalt bereds först.

koffeinreagens. 1 g rent koffein, 7,5 g natriumbensoat, 12,5 g natriumacetat löses i 90 ml destillerat vatten, upphettas till 50-60°C, omrörs, kyls och bringas till 100 ml med destillerat vatten.

Ammoniummolybdat i salpetersyra. 7,5 g ammoniummolybdat löses i 100 ml vatten och 100 ml 32% salpetersyra tillsätts.

Urin för alkaptonuri. I frånvaro av patologiskt tillsätts hydrokinon till normal urin med en hastighet av 20 g/l.

Urin med hyperaminoaciduri. I frånvaro av patologisk glycin tillsätts normal urin med en hastighet av 1,0 g/l.

Urin med mukopolysackaridos. I frånvaro av patologiskt tillsätts konsurid eller heparin till normal urin med en hastighet av 0,05-0,1 g / l.

Urin med pentosuri. I frånvaro av patologiskt tillsätts xylulos eller ribos till urinen med en hastighet av 1,0 g/l.

Urin med tyrosinos. I frånvaro av patologiskt tillsätts tyrosin till normal urin med en hastighet av 0,4-0,5 g / l.

Urin med fruktosuri. I frånvaro av patologiskt tillsätts fruktos till normal urin med en hastighet av 0,3-0,4 g / l.

Urin för cystinuri. I frånvaro av patologisk cystin tillsätts normal urin med en hastighet av 0,4-0,5 g / l.

Natriumacetat 3-vattenhaltig, mättad lösning. 375 g natriumacetat 3-vatten (eller 226 g vattenfritt salt) löses i 250 ml varmt vatten, kyls till rumstemperatur. Förvara i rumstemperatur. Lösningen ska vara färglös och transparent.

Natriumfosfat disubstituerad 0,25 mol/l. Förbered genom att lösa 9,7 g Na 2 HPO 4 ∙12H 2 O eller 18 g Na 2 HPO 4 ∙12H 2 O i vatten i en 200 ml kolv. När man tillsätter 2 ml av denna lösning till 1 ml triklorättiksyralösning bör pH-värdet vara i intervallet 5,0-6,0.

Kreatinin basisk kalibreringslösning, 10 mmol/l. 113,1 mg kreatinin justeras till 100 ml med 0,1 mol/l saltsyralösning. När man konstruerar en kalibreringsgraf, bereds en arbetslösning från stamlösningen genom att späda stamlösningen 100 gånger med vatten, 1 ml av lösningen innehåller 0,1 mmol kreatinin. Utifrån detta erhålls ett antal provrör med motsvarande koncentrationer av kreatin.

Oxiderande blandning för bestämning av tiamin. Till 8 ml 1% kaliumhexacyanoferrat (III) sätts 20 ml 30% NaOH-lösning, blanda noggrant. Förbered före användning.

Orcine reagens. Till 1 g orcin tillsätt 500 ml 30% saltsyra (densitet 1,15 g / cm 3). Rör om tills det löst sig och tillsätt 4-5 ml 10 % järnkloridlösning (III) FeCl3. Reagenset förvaras i en mörk flaska med tätt tillslut.

p-nitroanilin baskalibreringslösning. 0,0829 g p-nitroanilin placeras i en 100 ml mätkolv, späds till märket med vatten och löses upp.

Utfällningslösning. Lös 561 g ammoniumsulfat i 1 liter destillerat vatten och filtrera efter 24 timmar.

Basisk fosfatbuffertlösning och dess arbetslösningar nr 1-4. Lös 33,5 g NaOH i 400 ml vatten i en mätkolv med en kapacitet på 500 ml och tillsätt 226,8 g KH2PO4, skaka tills det är helt upplöst, kyl och tillsätt vatten till märket. För att framställa arbetslösningar av basisk fosfatbuffert, mäts följande volymer av basisk fosfatbuffert (i ml) i mätkolvar med en kapacitet på 100 ml: nr 1 - 92,51; nr 2 - 74,91; nr 3 - 59.18 och nr 4 - 48.68, varefter deras innehåll förs till märket med vatten.

Picrinsyra, mättad lösning. Commodity pikrinsyra innehåller 15-20% fukt, torka inte syran. Explosiv! Lös upp 2 g pikrinsyra i 100 ml vatten genom uppvärmning i ett varmt bad. Därefter får lösningen stå i 24 timmar under omrörning då och då. Lösningen filtreras sedan. Lösningen är stabil och förvaras i en mörk glasbehållare.

Pyrofosfatbuffert 0,05 M pH 8,2. Överför 4,46 g natriumpyrofosfat till en 200 ml mätkolv, lös den i cirka 100 ml vatten, justera pH med 0,1 M HCl-lösning till 8,2 och fyll på med destillerat vatten till markeringen.

Pyrofosfatbuffert 0,1 M pH 8,5. Överför 4,46 g natriumpyrofosfat till en mätkolv med en kapacitet på 100 ml, lös den i 50 ml vatten, justera pH med 0,1 M HCl-lösning till 8,5 och tillsätt destillerat vatten till märket.

Fungerande reagens. Förbered på bestämningsdagen genom att blanda 30 delar 0,3 N natriumhydroxid. 2 delar 0,5 % fenolftaleinlösning och 1 del 0,12 % kopparsulfatlösning.

Acetoncyanohydrinlösning. Lös 1 ampull acetoncyanohydrin (0,5 ml - 0,47 g från kitet för bestämning av hemoglobin i blodet) i 1 liter destillerat vatten.

Ferriacetoncyanohydrinlösning. Lös 200 mg kaliumferricyanid och 1 ampull (0,5 ml - 0,47 g) acetoncyanohydrin i 1 liter destillerat vatten: det är möjligt att använda från en uppsättning reagenser för att bereda en transformerande lösning för att bestämma blodhemoglobin. Hållbar i flera månader vid förvaring i en mörk glasbehållare i rumstemperatur.

Gluoxidaslösning. Innehåller ca 300 enheter. i 1 mg. Förbered genom att lösa lämplig mängd torrt preparat i 10 ml vatten.

En lösning av sulfonerad batofenantrolin. I ett provrör tillsätts 0,5 ml klorsulfonsyra till 100 mg badofenantrolin, värms i ett kokande vattenbad i 30 s, kyls och 10 ml dubbeldestillerat vatten tillsätts långsamt, värms igen i vattenbad under 5 minuter. Blandningen överförs till en 200 ml kolv, 100 ml vatten tillsätts, lösningens pH justeras till 4-5 N NaOH och vatten tillsätts till en volym av 200 ml.

Lösning av jod i kaliumjodid (Lugols lösning). Lös 20 g kaliumjodid och 10 g jod i 100 ml destillerat vatten. Före användning späds lösningen 5 gånger.

Lösning av p-nitrosodimetylanilin (NDMA). En kommersiellt tillgänglig NDMA-beredning omkristalliseras från etyleter. För att mäta alkoholdehydrogenas löses 1 mg NDMA i 100 ml 0,1 M pyrofosfatbuffert (pH 8,5). Den resulterande lösningen filtreras genom ett pappersfilter och filtratet späds 2 gånger med samma buffert. Förvaras vid 4°C i två månader.

Ilkas reagens. Till 5 delar (i volym) ättiksyraanhydrid, tillsätt 1 del isättika och häll sedan gradvis i 1 del koncentrerad svavelsyra. Förvara reagenset kallt!

Millon reagens. (Klar under press! ) 40 g kvicksilver löses i 57 ml koncentrerad salpetersyra, först i kylan och sedan upphettas i ett vattenbad. Den resulterande lösningen späds med 2 volymer vatten, får sedimentera och dräneras från sedimentet. Förvara i en mörk glasflaska.

Ammoniummolybdatreagens. 2,5 g ammoniummolybdat löses i 60 ml destillerat vatten, filtreras. Lösningen sätts till en 100 ml kolv. I en annan kolv tillsätts 7,5 ml koncentrerad svavelsyra till 25 ml destillerat vatten. Den andra lösningen tillsätts till den första, kyls och späds med destillerat vatten till märket. Lösningen är lämplig för en månad.

Reagens "NADI". En 1% lösning av dimetyl-p-fenylendiamin blandas med en lika stor volym av en 1% lösning av a-naftol i alkohol och en 1,5% natriumkarbonatlösning. Lösningen är mörkbrun till färgen och bör inte ha en rosa nyans. Förberedd 1 timme före lektionen.

Reagens Nasha. 15,4 g ammoniumacetat, 0,3 g isättika och 0,2 g acetylaceton sätts till en kolv med en kapacitet på 100 ml, löses i destillerat vatten och volymen justeras till märket.

Nesslers reagens. I en mätkolv med en kapacitet på 500 ml blandas 150 g kaliumjodid, 110 g jod, 100 ml destillerat vatten och ca 140-150 g metalliskt kvicksilver och skakas kraftigt i 15 minuter. I det här fallet värms lösningen spontant upp, och färgen på grund av det lösta jodet blir gradvis blek. Blandningen kyls sedan under rinnande vatten tills en distinkt röd färg bibehålls, varefter innehållet skakas tills den röda färgen övergår till grönaktig. Efter dekantering tvättas kvicksilverfällningen noggrant med vatten. Kombinera lösningen och tvättvätskorna, späd dem med vatten till 2 liter. Ta 75 ml av den resulterande lösningen i en 0,5 l mätkolv innehållande 75 ml vatten och 350 ml 10 % natriumhydroxidlösning och späd med vatten till märket.

Fehlings reagens. Två lösningar bereds separat. Lösning 1: Lös 200 g Rochelles salt och 150 g NaOH i en 1 L mätkolv och späd till märket med vatten. Lösning 2: i en mätkolv med en kapacitet på 1 l, lös 40 g koppar(II)sulfat i vatten och späd med vatten till märket. Blanda lika volymer av dessa lösningar före användning.

Folins reagens. Lös 1 g natriumvolframat och 20 g fosfomolybdensyra i 750 ml vatten i en 1 liters kolv. Stäng kolven med en propp med en återloppskylare och genom att slå på vattenflödet i kylskåpet, kokas innehållet i 10 timmar; sedan kyls den, hälls i en mätkolv och den vattenhaltiga volymen av reagenset justeras till 1 liter.

Erlichs reagens. 0,7 g p-dimetylaminobensaldehyd löses i 150 ml koncentrerad saltsyra, tillsätts till 100 ml vatten och blandas. Lösningen ska vara färglös eller svagt gul. Förvara i en mörk glasbehållare. Reagenset är stabilt.

Erlichs reagens. Lös 1 g p-dimetylaminobensaldehyd i en 50 ml mätkolv i 35 ml isättika, tillsätt 8 ml 57 % perklorsyra och späd till märket med isättika. Förvara i en mörk glasbehållare i kylen i upp till en vecka.

Tymol alkohollösning (10 %). 10 g renad tymol löses i 100 ml 96˚ etylalkohol. Att erhålla renad tymol utförs enligt följande. 100 g tymol löses i 100 ml 96˚ etylalkohol, filtreras. Tillsätt 1 liter kallt destillerat vatten till filtratet, skaka kraftigt och låt stå i 20 minuter. Filtret filtreras och de kvarvarande kristallerna på filtret tvättas två gånger med kallt destillerat vatten. Torka först på filterpapper, sedan i 2-3 dagar i en exsickator över vattenfri kalciumklorid till konstant vikt.

Standard lösning. Framställning av en standardlösning utförs genom att blanda två lösningar: 1) 0,0962 n lösning av bariumklorid: 1,175 g kristallin BaCl2 ∙2H2O löses i 100 ml vatten i en mätkolv. 2) 0,2 N svavelsyralösning. Därefter erhålls en suspension av bariumsulfat: 3 ml av en 0,0962 N lösning av bariumklorid hälls i en 100 ml mätkolv och volymen justeras med en 0,2 N lösning av svavelsyra vid en temperatur av + 10 ° C ( vid denna temperatur ger partikelstorlekarna för utfällt bariumsulfat ett relativt stabilt resultat).

Substratbuffertlösning: häll 10 ml vatten i ett provrör och tillsätt 0,028 g L-glutamyl-p-nitroanilin och 0,082 g natriumklorid och lös upp innehållet i provröret i ett kokande vattenbad i 60 sekunder utan att upphöra att röra om. . Lösningen kyls sedan till 37°C och 2,5 ml buffertlösning tillsätts. Den beredda substratlösningen förvaras i ett vattenbad vid 37°C under drift. Oanvänd substratlösning kan förvaras i kylen i upp till en vecka. Substratet är dåligt lösligt och fälls ut vid rumstemperatur. Därför, före användning, löses det kristalliserade substratet genom upphettning i ett kokande vattenbad. Uppvärmning och upplösning av substratet kan upprepas inte mer än två gånger.

Substratlösning för bestämning av ALT (lösning nr 1). Prover på 29,2 mg α-ketoglutarsyra och 1,78 g alanin (0,89 g α-alanin) vägs på en analytisk våg och löses i 1 M natriumhydroxidlösning tills fällningen är fullständigt upplöst (pH 7,4). Lösningen hälls i en 100 ml kolv och volymen justeras till märket med 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4). Tillsätt 1 droppe kloroform. Lösningen förvaras fryst i kylskåp.

Substratlösning för bestämning av AsAT (lösning nr 2). Prover på 29,2 mg a-ketoglutarsyra och 2,66 g a-asparaginsyra (1,33 g a-asparaginsyra) vägs på en analytisk våg. Därefter bereds lösningen på samma sätt som lösning nr 1.

Substratlösning för bestämning av glukosfosfatisomeras. Medinalacetatbuffertlösning pH 7,4 framställs (9,714 g natriumacetat och 14,714 g medinal löses i vatten och volymen justeras till 500 ml). Blanda 8,33 ml av 0,03 M lösning av dinatriumsalt av glukos-6-fosfat med 25 ml medial acetatbuffert; tillsätt 25 ml 0,1 M saltsyralösning till blandningen och späd till 100 ml med vatten. Håll kallt.

Substratlösning för bestämning av laktatdehydrogenas. Blanda 1 ml 1 M natriumlaktatlösning, 9 M NaCl-lösning, 0,05 M Cl2, 10 g/L NAD-lösning. 2,5 ml 0,5 M fosfatbuffertlösning (pH 7,4) och 1 g/l nitrotetrazoliumblåttlösning tillsätts till innehållet. Före användning tillsätts 0,25 ml av en lösning av fenanzinmetasulfat med en koncentration av 1 g / l till blandningen.

Substratlösning för bestämning av fruktosbisfosfataldolas. 270 mg av bariumsaltet av fruktosbisfosfat löses i 3,5 ml 1 M saltsyra. 1 ml 14 % natriumsulfatlösning tillsätts och den bildade fällningen avlägsnas genom centrifugering. Tillsätt 1 droppe natriumsulfat till supernatanten. Uppkomsten av grumlighet indikerar en otillräckligt fullständig avsättning av bariumjoner. I detta fall tillsätts mer natriumsulfat och centrifugeras igen. Centrifugatet justeras med en 3% natriumhydroxidlösning till pH 7,4-7,6, överförs till en 25 ml kolv och volymen justeras till märket. Den resulterande lösningen blandas med 25 ml av en 0,56 M lösning av hydrazinklorid, 25 ml av en 0,002 M lösning av monojodättiksyra, 100 ml av en 0,5% natriumkarbonatlösning och 25 ml destillerat vatten. Förvaras i kylen.

Tymol-veronal buffert. I en 100 ml mätkolv, blanda 80 ml av en buffertlösning och 1 ml av en 10% alkohollösning av tymol, skaka och tillsätt buffertlösningen till märket. pH-värdet ska vara 7,55.

o-toluidinreagens. 0,15 g tiourea löses i 94 ml isättika och blandas med 6 ml destillerad O-toluidin. Förvaras i mörk flaska.

Fenol mättad med vatten. 35 ml vatten tillsätts till 100 g destillerad fenol och rörs om, varvid blandningen upphettas något för att påskynda upplösningen av fenol.

Fenolftalen, arbetslösning. Bered genom att lösa 75 mg av ämnet i 15 ml 0,1 N natriumhydroxidlösning, lösningen ska vara färglös eller lätt rosaaktig, färgade lösningar är inte lämpliga för arbete. För att öka motståndet hos reagenset tillsätts 3 mg trilon till det, vilket, genom att binda salter av tungmetaller, förhindrar autooxidation av fenolftalein av atmosfäriskt syre.

Fibrin. Bovint blodfibrin tvättas från blodpigment i rinnande vatten i flera dagar tills en vit propp erhålls. Vatten pressas ut och fibrin, fyllt med glycerin, förvaras i en tättsluten burk. Före användning tvättas fibrin från glycerin.

Fosfor-vanillin reagens. 4 delar (i volym) koncentrerad fosforsyra blandas med 1 del av en 0,6% vattenlösning av vanillin. Reagenset förvaras i en mörk glasbehållare vid rumstemperatur.

Fruktos 1,6-bisfosfat, natriumsalt. 2,0 ml av en 10 % lösning av natriumsalt av fruktos-1,6-bisfosfat späds i en 25 ml kolv med vatten till märket. Stabil vid förvaring i kylskåp.

Färgreagens för urea. Tabletten från kitet för bestämning av urea innehållande diacetylmonooxim och tiosemikarbazid löses upp genom upphettning i en 50 ml kolv. Lösningen är stabil i tre veckor. Före användning, blanda lika volymer av den beredda lösningen och en 9,6 % svavelsyralösning.

Alkalisk lösning av β-glycerofosfat. Tillsätt 1 g natrium-β-glycerofosfat och 0,85 g medinal i en mätkolv med en kapacitet på 100 ml, tillsätt cirka 30 ml destillerat vatten, lös upp och bring volymen till märket med vatten. Tillsätt i en annan mätkolv med en kapacitet på 100 ml 50 ml av den beredda lösningen av β-glycerofosfat, 2,8 ml 0,1 M natriumhydroxidlösning och för till märket med destillerat vatten (lösning pH 8,6). Lägg på vätskan ca 3 ml toluen. Förvara lösningen i kylskåpet i högst 10 dagar.

Ta blod, förbereda ett "tunt utstryk" och "tjock droppe"

rörelse av bakterier. Flagellets struktur, tjocklek, längd, kemisk sammansättning. Framställning av fixerade preparat och preparat av levande celler av mikroorganismer.

Kemiskt rena reagens används för att framställa buffertlösningar. och analytisk betyg, särskilt förberedda. Reagens framställs enligt följande.

Kaliumfosfat monosubstituerad, KH 2 PO 4 , molekylvikt 136,09. 100 g av läkemedlet löses vid upphettning till kokning i 150 ml vatten. Lösningen filtreras varm. Under konstant omrörning kyls filtratet till 10 ºС. Tillsätt sedan 150 ml etylalkohol. Kristallerna separerade under konstant omrörning av filtratet filtreras av på en sugtratt och omkristalliseras igen under samma betingelser; kristallerna torkas till konstant vikt vid 105...110 ºС. I närvaro av en beredning med innehållet av huvudämnet i intervallet 99,9 ... 100,0%, utförs inte preliminär beredning av ämnet.

Disubstituerat natriumfosfat, Na2HPO412H2O, molekylvikt 358,12. Det finns två sätt att förbereda läkemedlet.

a) 150 g av läkemedlet löses i 150 ml vatten vid upphettning till 100°C. Lösningen filtreras varm och efter kylning filtreras de utfällda kristallerna bort. Omkristallisering upprepas genom uppvärmning till 100 ºС. Det omkristalliserade preparatet upphettas i en porslinskopp i ett vattenbad under kontinuerlig omrörning tills preparatet är helt torrt. Det resulterande saltet torkas i en exsickator över smält kalciumklorid under dagen. I det omkristalliserade preparatet (Na 2 HPO 4 · 2H 2 O) kontrolleras innehållet av huvudämnet. För att göra detta löses cirka 0,5000 g av läkemedlet i 50 ml vatten, 2 ... 3 ml av en mättad natriumkloridlösning tillsätts och titreras med en 0,1 N saltsyralösning i närvaro av en indikator av metylrött . Om det behövs, gör justeringar av storleken på provet. 1 ml av exakt 0,1 N saltsyra motsvarar 0,0178 g Na 2 HPO 4 2H 2 O.

b) 75 g av läkemedlet löses i 250 ml vatten uppvärmt till 60 ºС. Lösningen filtreras varm, filtratet kyls under konstant omrörning till 10 ºС. De utfällda kristallerna filtreras av på en sugtratt och omkristalliseras igen under samma betingelser. Det resulterande saltet torkas först vid en temperatur som inte överstiger 30 ºС i 24 timmar, sedan fortsätter det att torka i en ugn vid 50 ºС i 3-4 timmar och slutligen vid 120±5 ºС till konstant vikt, vilket förhindrar saltet från att smältande. Efter torkning har saltet sammansättningen Na2HPO4.

Efter beredning av reagenserna framställs stamlösningar av monosubstituerad kaliumfosfat och disubstituerad natriumfosfat.

En portion vattenfri kaliumfosfat monosubstituerad KH2PO4 vägande 9,078 g löses i vatten och volymen av lösningen justeras till 1 liter. För att stabilisera lösningen tillsätt 3-4 droppar toluen.

En portion natriumfosfat disubstituerad Na2HPO412H2O, vägande 11,876 g, löses i vatten och volymen av lösningen justeras till 1 liter. För att stabilisera lösningen tillsätt 3-4 droppar toluen.

Från de initiala lösningarna framställs fosfatbuffertlösningar med ett pH på 4,94 till 9,18 i enlighet med tabell A.2.

Tabell A.2 - Fosfatbuffertlösning med ett pH på 4,94 ... 9,18

pH	Na2HPO4 12H2O-lösning, ml	KH2PO4-lösning, ml
4,94	1,0	99,0
5,29	2,5	97,5
5,59	5,0	95,0
5,91	10,0	90,0
6,24	20,0	80,0
6,47	30,0	70,0
6,64	40,0	60,0
6,81	50,0	50,0
6,98	60,0	40,0
7,17	70,0	30,0
7,38	80,0	20,0
7,73	90,0	10,0
8,04	95,0	5,0
8,34	97,5	2,5
8,67	99,0	1,0
9,18	100,0	0,0

Tillagt datum: 2015-08-06 | Visningar: 4058 |

Buffertlösningarnas pH beräknas enligt Henderson-Hasselbachs ekvation:

– för en sur buffert har ekvationen formen

– för huvudbufferten

Ekvationerna visar att pH-värdet för en buffertlösning av en given sammansättning bestäms av förhållandet mellan koncentrationerna av syra och salt eller bas och salt, och därför inte beror på utspädning. När lösningens volym ändras ändras koncentrationen av varje komponent lika många gånger.

Buffertkapacitet

Buffertlösningarnas förmåga att hålla ett konstant pH är begränsad. De där. tillsats av syra eller alkali utan att väsentligt ändra buffertlösningens pH är endast möjligt i begränsade mängder.

Värdet som kännetecknar en buffertlösnings förmåga att motverka förändringen i mediets reaktion när syror och alkali tillsätts kallas lösningens buffertkapacitet (B).

Buffertkapaciteten mäts genom antalet molekvivalenter av en stark syra eller bas, vars tillsats till 1 liter av en buffertlösning ändrar pH med ett.

Matematiskt definieras buffertkapaciteten enligt följande:

B med syra (mol/l eller mmol/l):

,

där n(1/z HA) är antalet molekvivalenter av syran, pH 0 och pH är buffertlösningens pH före och efter tillsatsen av syran, VB är buffertlösningens volym.

I alkali (mol/l eller mmol/l):

,

där n (1/z VOH) är antalet molekvivalenter alkali, resten av beteckningarna är desamma.

Buffertkapaciteten beror på ett antal faktorer:

1. Från typen av tillsatta substanser och komponenter i buffertlösningen. Därför att vissa ämnen kan bilda olösliga föreningar eller komplex eller ge andra oönskade reaktioner med komponenterna i buffertsystemet, då förlorar begreppet buffertkapacitet sin mening.

2. Från den initiala koncentrationen av komponenterna i buffertsystemet.

Ju större antalet komponenter i syra-basparet i lösningen, desto större buffertkapacitet har denna lösning.

Gränsen för förhållandet mellan koncentrationerna av komponenterna i buffertlösningen, vid vilken systemet fortfarande behåller sina egenskaper. pH-intervallet = pK ± 1 kallas zonen för systemets buffertverkan. Detta motsvarar intervallet för förhållandet Med salt /C till-dig från 1/10 till 10/1.

B till (blod) \u003d 0,05 mol / l; B till (plasma) \u003d 0,03 mol / l; B till (serumblod) = 0,025 mol/l

Blodbuffertsystem

Buffertsystem är särskilt viktiga för att upprätthålla syra-basbalansen hos organismer. pH-värdet för de flesta intracellulära vätskor ligger i intervallet från 6,8 till 7,8.

Syra-basbalansen i mänskligt blod tillhandahålls av hydrokarbonat-, fosfat-, protein- och hemoglobinbuffertsystem. Det normala pH-värdet för blodplasma är 7,40 ± 0,05.

Hemoglobinbuffertsystemet ger 35 % buffertkapacitet i blodet: . Oxyhemoglobin är en starkare syra än reducerat hemoglobin. Oxyhemoglobin är vanligtvis i form av ett kaliumsalt.

Karbonatbuffertsystem : rankas först när det gäller makt. Det representeras av kolsyra (H 2 CO 3) och natrium- eller kaliumbikarbonat (NaHCO 3, KHCO 3) i förhållandet 1/20. Bikarbonatbuffert används i stor utsträckning för att korrigera syra-basrubbningar i kroppen.

Fosfatbuffertsystem . Dihydrofosfat har egenskaperna hos en svag syra och interagerar med alkaliska produkter som kommer in i blodomloppet. Hydrofosfat har egenskaperna hos en svag alkali och reagerar med starkare syror.

Proteinbuffertsystemet spelar rollen som neutraliserande syror och alkalier på grund av dess amfotera egenskaper: i en sur miljö beter sig plasmaproteiner som baser, i en basisk - som syror:

Buffertsystem finns också i vävnader, vilket bidrar till att bibehålla pH i vävnader på en relativt konstant nivå. De huvudsakliga vävnadsbufferterna är proteiner och fosfater. Att bibehålla pH sker också med hjälp av lungor och njurar. Överskott av koldioxid avlägsnas genom lungorna. Njurar med acidos utsöndrar mer surt monobasiskt natriumfosfat, och med alkalos - mer alkaliska salter: dibasiskt natriumfosfat och natriumbikarbonat.

Exempel på problemlösning

Lösning:

Vi beräknar pH för syrabuffertlösningen med formeln

Svar: 5,76

Lösning:

Vi beräknar buffertkapaciteten med formeln:

Svar: 0,021 mol/l

Exempel 3

Buffertlösningen består av 100 ml 0,1 mol/l ättiksyra och 200 ml 0,2 mol/l natriumacetat. Hur kommer pH-värdet på denna lösning att förändras om 30 ml 0,2 mol/l natriumhydroxidlösning tillsätts.

Lösning:

Vi beräknar buffertlösningens pH med formeln:

När NaOH tillsätts till buffertlösningen ökar mängden salt och mängden syra i buffertlösningen minskar:

0,006 0,006 0,006

CH 3 COOH + NaOH \u003d CH 3 COONa + H 2 O

Vi beräknar n (NaOH) \u003d 0,03 l 0,2 mol / l \u003d 0,006 mol, därför, i buffertlösningen, minskar mängden syra med 0,006 mol, och mängden salt ökar med 0,006 mol.

Vi beräknar lösningens pH med formeln:

Följaktligen: pH 2 - pH 1 = 5,82 - 5,3 = 0,52

Svar: buffert pH-förändring = 0,52.

Uppgifter för självständig lösning

4. För att titrera 2 ml blod för att ändra pH från initialvärdet (7,36) till slutvärdet (7,0), var det nödvändigt att tillsätta 1,6 ml av en 0,01 M HCl-lösning. Beräkna syrabuffertkapaciteten.

5. Hur många mol natriumacetat måste tillsättas till 300 ml ättiksyra för att minska koncentrationen av vätejoner med 300 gånger (K ​​dis (CH 3 coon) = 1.85.10 -5).

6. I biokemiska studier används en fosfatbuffert med pH = 7,4. I vilket förhållande ska lösningar av natriumvätefosfat och natriumdivätefosfat blandas med en koncentration av 0,1 mol / l vardera för att erhålla en sådan buffertlösning (pK (H 2 PO 4 -) \u003d 7,4).

7. Vilka överträdelser av CBS observeras med följande indikatorer: blod pH = 7,20, Pco 2 = 38 mm Hg. Art., BO = 30 mmol/l, SBO = -4 mmol/l. Hur eliminerar man denna kränkning av KOS?

Testuppgifter

Tween-20 fosfattvättbuffert för immunhistokemi är ett koncentrat (20x) som, efter spädning, används för att tvätta objektglas av reagenser och korttidsförvaring av immunhistokemiprover mellan procedurerna. Efter spädning har en bruksfärdig 0,01 M lösning ett pH på 7,4±0,1. Användningen av denna fosfatbuffrade koksaltlösning gör det inte bara möjligt att tillhandahålla tvätt av hög kvalitet, utan också att bevara de morfologiska egenskaperna hos de använda antikropparna och deras epitoper, vilket underlättar den specifika bindning som krävs för den immunhistokemiska reaktionen. Tillsatsen av Tween-20 till PBS främjar effektivare tvättning och förhindrar ospecifik färgning.

Våra fördelar:

För närvarande samarbetar vi med ledande utländska tillverkare av laboratoriereagens. Våra kunder är både icke-statliga och statliga institutioner, inklusive medicinska organisationer i Moskva och andra städer i Ryssland. För stamkunder finns ett system med rabatter.